肿瘤干细胞在人结肠癌细胞株HT29耐奥沙利铂中作用探讨.docVIP

肿瘤干细胞在人结肠癌细胞株HT29耐奥沙利铂中作用探讨 　　[摘要] 目的 探讨肿瘤干细胞（cancer stem cell，CSC）在人结肠癌细胞株HT29对奥沙利铂（L-OHP）产生获得性耐药中的作用。 方法 采用浓度递增法诱导产生人结肠癌耐奥沙利铂细胞株HT29/L-OHP。采用As2O3逆转HT29/L-OHP的耐药性。采用MTT法检测As2O3逆转前后HT29/L-OHP的增殖能力和对L-OHP的敏感性。采用实时荧光定量PCR检测As2O3逆转前后HT29/L-OHP中Sox-2、miR-200c和let-7的表达。 结果 ①在L-OHP（12 μmol/L） 的作用下，HT29/L-OHP的增殖能力显著高于HT29（P 0.05）。HT29和HT29/L-OHP对L-OHP的IC50分别为12.1 μmol/L和138.4 μmol/L，耐药指数为11.44。②0.20 mg/L 的As2O3预处理后，降低了HT29/L-OHP对L-OHP的耐药性，逆转倍数为3.76，相对逆转效率为80.4%。③相对于HT29，HT29/L-OHP中Sox-2的表达显著增加[（0.072±0.038）比（0.019±0.010）]（P 　　[关键词] 结肠癌；耐药；奥沙利铂；肿瘤干细胞 　　[中图分类号] R735.35 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）07（b）-0007-04 　　在我国，结肠癌的发病率和死亡率均较高[1-2]，因此，结肠癌的治疗对于民生具有重要的意义。奥沙利铂（Oxaliplatin，L-OHP）是一种铂类化疗药物，是治疗结肠癌的一线化疗药物。但是结肠癌细胞容易对L-OHP产生耐药性，这是结肠癌化疗失败的主要原因之一[3]。许多研究对这一现象及其机制进行了探讨[4-5]，但是肿瘤干细胞（cancer stem cell，CSC）是否参与了这一过程并不清楚。本研究以L-OHP为诱导剂，建立了人结肠癌L-OHP耐药细胞株，观察了肿瘤干细胞标志物的表达，以探讨CSC在结肠癌细胞对L-OHP产生获得性耐药中的作用。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　人结肠癌细胞株HT29购自南京凯基科技生物发展有限公司；MTT试剂盒购自美国Sigma公司；L-OHP 购自江苏恒瑞医药股份有限公司；TRIzol试剂购自美国 Invitrogen公司；RPMI 1640培养基和小牛血清购自美国Gibico公司；As2O3购自哈尔滨伊达药业有限公司；RNA提取试剂盒购自德国QIAGEN公司；逆转录酶和Taq酶购自美国Promega公司。 　　1.2 实验方法 　　1.2.1 细胞培养 　　HT29的耐药株和亲本株均采用RPMI 1640（含10%的小牛血清）培养，于恒温37℃且含有5%体积CO2的细胞培养箱中培养。 　　1.2.2 人结???癌耐L-OHP细胞株的诱导 　　采用药物浓度递增和间歇诱导相结合的方法诱导人结肠癌耐L-OHP细胞株。L-OHP浓度从4 μmol/L开始最终增加到16 μmol/L，最终获得可耐受16 μmol/L L-OHP的细胞HT29细胞株，命名为HT29/L-OHP，维持培养于含4 μmol/L L-OHP的正常培养液中，后续实验前1周撤药。 　　1.2.3 MTT法 　　MTT是一种染料，在活细胞的作用下，外源性的MTT被线粒体中的琥珀酸脱氢酶转变为蓝紫色结晶物，采用二甲基亚砜溶解此结晶物后，在540 nm波长处测定光密度值，可以根据此光密度值间接推算活细胞的数量。 　　1.2.4 生长曲线测定 　　将对数生长期的HT29及HT29/L-OHP细胞制成细胞悬液，细胞密度调整为1.5×104/mL，接种于96孔板中，MTT法测定每孔的吸光度（OD值），连续测定7 d，绘制生长曲线。倍增时间计算公式如下：TD=T×lg2 /lg（Nt/N0），其中，TD为倍增时间（h），T为细胞数目由N0增殖到至Nt所用的时间。整个实验分为三组：HT29/L-OHP+L-OHP组（12 μmol/L L-OHP处理的HT29/L-OHP细胞），HT29+L-OHP组（12 μmol/L L-OHP处理的HT29细胞），HT29组（无L-OHP的HT29细胞）。 　　1.2.5 HT29和HT29/L-OHP细胞对L-OHP敏感性的测定 　　将HT29及HT29/L-OHP细胞接种于96孔板中，采用不同浓度的L-OHP处理，所用浓度分别为0.1、1、10、100、1000 μmol/L。培养72 h后测定每孔的吸光度，计算细胞存活率、半数抑制浓度（IC50）和耐药指数（resistance index，RI）。细胞存活率=实验组OD值/对照组OD值