胃癌肝高转移潜能细胞特异性结合肽与肿瘤坏死因子融合与鉴定.docVIP

胃癌肝高转移潜能细胞特异性结合肽与肿瘤坏死因子融合与鉴定 　　[摘要] 目的 将胃癌肝高转移潜能细胞特异性结合肽pd20与人肿瘤坏死因子α（TNF-α）进行基因融合，并构建原核表达载体，表达pd20-TNF-α融合蛋白。 方法 利用全基因合成法制备pd20-TNF-α融合基因，构建pd20-TNF-α原核表达载体，在大肠杆菌BL21中进行诱导表达。对表达产物进行SDS电泳分析和Western blot检测分析。 结果 成功构建了pd20-TNF-α重组融合质粒，表达的蛋白经SDS电泳分析，在相对分子质量约21 000处出现了1条新生的蛋白条带，转印NC膜后该融合蛋白可与抗TNF-α单克隆抗体特异性结合。 结论 成功构建了pd20-TNF-α基因的原核表达载体，并在大肠杆菌中进行诱导表达，为下一步融合蛋白的纯化奠定了实验基础。 　　[关键词] 基因融合；原核表达载体；重组融合蛋白；鉴定 　　[中图分类号] Q785 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）09（c）-0008-04 　　肿瘤坏死因子α（TNF-α）是一种多功能的细胞因子，对多种肿瘤具有明显的抑制作用，但是由于全身用药，副作用较大，限制了它的临床应用。笔者曾采用噬菌体随机肽库筛选技术，筛选到可与胃癌肝高转移潜能细胞特异性结合的线性多肽分子GRRTRSRRLRRS（pd20），实验证实pd20可与胃癌肝高转移潜能细胞特异性结合，并且裸鼠体内实验证实pd20具有胃癌肝转移的导向性，有可能作胃癌肝转移的靶向载体[1-2]，为了发挥pd20的胃癌肝转移靶向性以及减少TNF-α全身用药的毒副作用，本实验欲运用基因工程方法将pd20与TNF-α进行基因融合，以期达到靶向性治疗胃癌肝转移的作用。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　质粒PET28a（+）与TNF-α（人源），大肠杆菌E. coli DH5α和E.coli BL21，及各种限制性内切酶，T4DNA连接酶，质粒提取试剂盒，胶回收试剂盒均购自上海闪晶分子生物科技有限公司；蛋白分子标记（marker）购买于Fermentas公司；抗TNF-α单克隆抗体购自Santa Cruz公司；羊抗小鼠二抗和碱性磷酸酶显色试剂盒购自华美生物工程有限公司。 　　1.2 方法 　　1.2.1 pd20-TNF融合基因设计合成 胃癌肝高转移潜能细胞特异性结合肽pd20的氨基酸序列为GRRTRSRRLRRS参照Genbank上NM-000594.2序列，全基因合成法制备pd20-TNF-??基因，3端和5端分别引入的Nde I、Xho I酶切位点。 　　1.2.2 含有pd20-TNF-α基因原核表达载体的构建 将原核表达载体pet28a（+）和合成的pd20-TNF-α基因的核酸链分别用Nde I、Xho I双酶切后，经1%的琼脂糖电泳后用胶回收试剂盒回收目的片段，1%琼脂糖凝胶电泳检测结果，然后将回收的目的片段来进行连接构建表达载体。连接产物转化DH5α感受态细胞中，轻轻混匀进行冰浴，时间为30 min；后42℃热休克1.5 min，随后在冰水混合物中再次冰浴2 min，加入600 mL LB培养基中，37℃震荡培养1 h。离心5 min，收集菌体，用200 μL LB液体培养基重悬细菌后均匀涂布于LB平板（含氨苄青霉素（50 μg/mL）上，37℃温箱中培养16～18 h。挑取6个阳性菌落，分别进行PCR和双酶切鉴定。并送往上海生工生物技术有限公司进行测序，将测序结果与GenBank的Blast比对，分析其同源性。 　　1.2.3 pet28a- pd20-TNF-α重组质粒的PCR鉴定 挑选重组菌落培养后Triton法提取质粒DNA，并进行PCR鉴定。PCR引物为336-FCCAAATCATATGGGTCGTCGTACCCGTTCTCGT，336-R ATTTGGCTCGAGTCACAGGGCAA TGATCCCAAA。 　　1.2.4 pet28a- pd20-TNF-α重组质粒的酶切鉴定 将PCR鉴定正确的重组质粒用Nde I和Xho I进行双酶切鉴定。后者再经DNA序列测定，确定出序列正确的重组质粒，将其命名为Pet28a（+）-pd20-TNF-α。 　　1.2.5 重组蛋白的诱导表达 将鉴定正确的重组质粒克隆于LB液体培养基中，37℃振摇培养过夜约16 h，以1∶100分别接种于LB和含Kana 100 μg/mL的种子液培养基中，37℃震荡培养至OD600为0.5时，加入1 mol/L的IPTG到终浓度为1.0 mmol/L，继续培养4 h，离心法收集菌体，行SDS。 　　1.2.6 SDS及Western Blot检测 将样品进行SDS电泳， 考马斯亮蓝染色。