第三节 核酸化学3.ppt

二．核酸的两性性质及等电点 核酸分子中既含有酸性基团（磷酸基）也含有碱性基团（氨基），具有两性性质。 由于核酸分子中的磷酸是一个中等强度的酸，而碱性（氨基）是一个弱碱，所以核酸的等电点比较低。如DNA的等电点为4～4.5，RNA的等电点为2～2.5。 RNA的等电点比DNA低的原因，是RNA分子中核糖基2′-OH通过氢键促进了磷酸基上质子的解离。DNA没有这种作用。 三、核酸的紫外吸收 由于嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键体系（单双键交替）； 一般在260nm左右有最大吸收峰， 可以作为核酸及其组份定性和定量测定的依据。 DNA变性 一般DNA的Tm值在70-85?C之间。 DNA的Tm值与分子中的G和C的含量有关。 G和C的含量高，Tm值高。因而测定Tm值，可反映DNA分子中G, C含量。 2、 核酸的复性（renaturation) 将热变性后的DNA溶液缓慢冷却，在低于变性温度约25～30℃的条件下保温一段时间（退火），则变性的两条单链DNA可以重新互补而形成原来的双螺旋结构并恢复原有的性质。 热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为退火(annealing) 。 在适当条件下（退火） ，变性DNA的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性。 一系列性质将得到恢复，但是生物活性一般只能得到部分的恢复。 DNA复性主要受三种因素的制约： 1)将热变性的DNA骤然冷却至低温时，DNA不可能复性。 但是将变性的DNA缓慢冷却时（比Tm低25 ℃左右最佳），可以复性。 2）DNA浓度较高时，两条互补链彼此相碰的机会增加，易于复性。重复片段越多，复性越快。 3）DNA片段的大小：DNA片段越大，复性越慢 DNA复性 复性速度可用Cot1/2来衡量。 Co为变性DNA复性时的初始浓度，以mol·L-1，t为时间，以秒表示。 Cot1/2的单位是mol·L-1.S Cot1/2表示复性一半的Cot值，与速率成反比，Cot1/2增大意味着反应速度变慢。 3、 核酸的杂交 热变性的DNA单链，在复性时可与同源DNA互补链形成双螺旋结构，它也可以与在某些区域有互补序列的异源DNA单链形成双螺旋结构。 两条来源不同的单链核酸（DNA或RNA），只要它们有大致相同的互补碱基顺序，经退火处理即可复性，形成新的杂种双螺旋，即核酸的分子杂交。 DNA-DNA杂交；DNA-RNA杂交。 不同来源的，具有大致相同互补碱基顺序的核酸片段称为同源序列。 核酸的杂交 Southern blotting(印迹） 将待检测的DNA分子用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。?  用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态,?如是否有点突变、扩增重排等。?? Northern blotting 原理： 在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。 用途： 检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。 5、核酸的水解 （1）酸或碱水解 核酸分子中的磷酸二酯键可在酸或碱性条件下水解切断。 DNA和RNA对酸或碱的耐受程度有很大差别。 在0.1 mol/L NaOH中，RNA几乎可以完全水解，生成2′-或3′-磷酸核苷； DNA在同样条件下则不受影响。 这种水解性能上的差别，与RNA核糖基上2′-OH的邻基参与作用有很大的关系。在RNA水解时，2′-OH首先进攻磷酸基，在断开磷酯键的同时形成环状磷酸二酯，再在碱的作用形成水解产物。 2）、酶水解 凡是能水解核酸的酶都称为核酸酶。 从多核苷酸链的末端开始水解核酸的酶称为核酸外切酶； 从多核苷酸链中间开始水解核酸的酶称为核酸内切酶。 能识别特定的核苷酸顺序，并从特定位点水解核酸的内切酶称为限制性核酸内切酶（限制酶） （restriction nuclease ）。 以DNA为底物的DNA水解酶（DNases）和以RNA为底物的RNA水解酶（RNases）。 五、核酸的分离纯化、测定及研究方法 1、紫外吸收法 2、 定糖法 3、 定磷法 四、核酸序列测定 （一）分离核酸的一般原则 因为遗传信息全部贮存在核酸的一级结构中，故完整的一级结构是保证核酸结构与功能研究的基础。 保证核酸一级结构的完整性； 排除其它分子的污染。