分子生物学讲座3.pptVIP

第三讲 分子克隆的最基本操作 PCR 的反应体系 模板DNA（template） 引物（primer）:与被分离的目的基因的DNA双链两 端序列相互补的DNA，约20个碱基左右； TaqDNA 聚合酶／pfu高保真聚合酶； dNTP 缓冲液（buffer） （PCR增强剂） 一般PCR反应可扩增出100—5000bp的目的基因 PCR基本反应过程 1，变性 95℃，双链解开成单链 2，退火 55℃左右，引物配对 3，延伸 72℃，合成新链 30个循环左右 PCR 的目的? 引物的设计 1、引物长度（primer length） 常用的是18-24 bp，不要大于38，因为过长会导 致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进 行反应。 2. 引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。 GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引 物的GC含量不能相差太大。 另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解 链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。 有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。 若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引 物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近