核酸纯化的问题解答.docVIP

本来只打算将旧有的一些东西简单整理一下贴上，现在看来，还是重新写一些吧。旧的东西只适合使用人员，现在在许多论坛可以找到；这次写的，涉及一些基础一些的东西，产品开发人员也可以参考。下面是我肯定会讲到的大的方面，发贴先后次序可能颠倒；如果大家对没有涉及的方面感兴趣，可以提出来，我会尽可能补充的。1：吸附柱技术简介2：核酸抽提技术的比较3：常用总 RNA 抽提技术的评价4：常用基因组 DNA 抽提技术的评价5：常用片段纯化技术的评价6：常用质粒抽提技术的评价7：科研用核酸抽提技术的可能发展从 Ambion 公司的 RiboPure Kit 谈起最近 Ambion 推出了一个产品：使用 TRI Reagent 裂解样品的柱式总 RNA 抽提试剂盒。该产品被 Ambion 推荐为抽提 Microarray 用总 RNA 的首选。如果你知道 Ambion 已经提供有 TRI Reagent 和不使用苯酚的柱式总 RNA 抽提试剂盒产品，会有什么想法？从 Ambion 劳民伤财地提供这样一个或伤财或既劳民又伤财的产品，可以看出经典类的 TRI Reagent 抽提和不使用苯酚的柱式抽提方法，都是有一些不足的：经典的 TRI Reagent 方法，长于去除蛋白质，短于去除了蛋白质以后的纯化；不使用苯酚的柱式方法，长于去除了蛋白质以后的操作，却短于去除蛋白质。经典方法和柱式方法各自的不足，不仅仅存在于 RNA 抽提，也不是不可克服的。实际上，绝大部分使用人员都可以使用过去的方法获得比较满意的结果。以后我要展开的，可以成为顺利者自我表扬和不顺者自我检讨的素材。天助自助者！附：TRIzol 操作解析1：样品的裂解 - 根据你的样品，选择一个使用方法。A： 组织的裂解 方法 a：加入 TRIzol，用玻璃匀浆器 (少量的可以使用 Pellet Pestle) 将组织彻底匀浆。将匀浆液移入离心管中。方法 b：液氮冷冻条件下将组织捣碎成粉末。在液氮完全挥发前，将捣碎的组织移入已经加入了 TRIzol 的离心管中，立即用移液器吹打混匀。B： 细胞的裂解a：( 悬浮培养细胞 ) 300 x g 离心 5 分钟后彻底弃上清。加入 TRIzol，立即用移液器吹打以彻底混匀。b：( 贴壁培养细胞 ) 将培养皿中的培养液彻底弃干净。将 TRIzol 直接加在培养皿中的细胞上。立即用移液器吹打使细胞脱壁后，将裂解液移入离心管中。C： 人血液的裂解先低速离心或者使用其它方法获得白细胞，再按照悬浮培养细胞操作。? 下面是 1 ml TRIzol 可以裂解的样品最大量。你可以根据你的具体样品量增加或者减少 TRIzol 的用量，但 TRIzol 的最小用量建议不低于 0.8 ml：动物组织的裂解：最大起始量 30 - 100 mg。(高核酶/核酸含量的、高脂肪含量的动物组织；最大起始量 30 - 50 mg，其它的动物组织，最大起始量 50 - 100 mg。)悬浮培养细胞的裂解：最大起始量 5 - 10 x 106。贴壁培养细胞的裂解：如果是直接在培养器皿中裂解，不管细胞数量是多少，最大起始量为 10 cm2。如果使用机械或者酶消化使细胞脱壁收集后再裂解，则按悬浮培养细胞对待。使用 TRIzol LS Reagent 更经济、可靠。人全血的裂解：先获得白细胞，再按照悬浮培养细胞操作。植物组织的裂解：最大起始量 100 mg，使用方法 b 裂解。? 如果同时要抽提多个样品，为防止 RNA 降解，正确的操作是：一次取出一个样品，彻底匀浆后，置于冰上；再取出一个样品，同样处理，直到所有样品全部彻底匀浆。再同步进行下一步操作。? 操作必须非常快速，才能确保 RNA 不被降解。另外，样品量一定不要超过许可的范围，否则将导致一系列问题。? 如果同时要抽提 RNA 和 DNA，不能使用电动匀浆器匀浆。用注射器抽打裂解物能帮助裂解，提高得率。但如果同时要抽提长片段基因组 DNA，则不能使用注射器抽打。2：根据样品，选择使用方法 A 或者方法 B。如果不确定，则使用方法 B。A (细胞，血液，一般动物组织) - 室温静置 5 分钟。再按照 1 ml TRIzol 使用 200 ul 的比例加入氯仿，用力颠倒离心管以混匀。室温静置 2 - 15 分钟使之分层后，4OC 12,000 x g 离心 15 分钟。B (植物，脂肪及肝脏等某些杂质含量较高的样品) - 室温静置 5 分钟后，4OC 12,000 x g 离心 10 分钟，将上清移入另外一个离心管中。再按照 1 ml TRIzol 使用 200 ul 的比例加入氯仿，用力颠倒离心管以混匀。室温静置 2 - 15 分钟使之分层后，4OC 12,000