第三章酶的纯化09.pptVIP

3．6 酶的分离与纯化 ?酶蛋白经的分离与纯化后，可获得去除杂蛋白的纯酶，从而可研究酶学性质，如酶的pH特性，温度特性，分子量，pI, Km等。 ３.６.1、吸附分离法： 利用蛋白质与吸附剂之间的分子吸附力(范德华力，包括色散力、诱导力、定向力以及氢键)的差异而实现分离的方法。 吸附剂（固体）对无细胞提取液或培养滤液中各种物质（组分）吸附力不同而预以分离，吸附剂结合酶后，离心收集结合了酶的吸附剂，并用适当的缓冲液洗涤，以去除未结合的蛋白和溶液，通过调节洗脱液的pH与离子强度，使吸附酶解吸，得到纯化的酶蛋白。 常用的吸附剂有： （1）氢氧化铝凝胶 （2）羟基凝灰石（Hydroxyapatie，简称HA），结构式为Ca10(PO4)6(OH)2，由于它具有均一晶形，装柱后流速稳定，与蛋白质结合好，故广泛应用于蛋白质和核酸的分离。由于HA表面具有较多的Ca2+与PO43-，是用以分离高分子物质的二种基团。 （3）其它吸附剂，白土、硅藻土、活性碳等 选用吸附剂，具体酶具体考虑吸附剂和操作条件，先做小样试验，摸索条件，决定吸附、洗脱的因素，主要有pH、离子浓度、蛋白浓度、吸附剂与蛋白的比例等，如果是吸附酶蛋白，整个过程则包括吸附、洗涤和洗脱三个环节。 高岭土吸附菠萝蛋白酶 用高岭土吸附菠萝蛋白酶。将八成熟的菠萝去皮，压榨，过滤(或离心)取上清液(此时pH约为4-6)，加入5％的高岭土，搅拌吸附一定时间后，分离，收集吸附土，用NaCO3调pH6.5—7.0，然后加NaCl或硫酸铵进行洗脱，当洗脱液的体积达到原菠萝汁体积的1/5时，其洗脱率为70％一85％。 3.6.2、凝胶过滤（Gel Filtration） ?凝胶过滤(Gelfitration)即凝胶过滤层析(Gelfitration Chromatography)，也称分子排阻层析(Molecular-Exclusion)、分子筛层析(Moleculai-Sieve Chromatography)，是根据分子大小分离纯化酶最有效的方法之一。 以各种多孔凝胶为固定相，利用溶液中各组分的分子量不同而进行分离的技术。 大分子物质由于分子直径较大，难以进入凝胶颗粒的微孔，只能分布在凝胶颗粒的间隙中，随流动相向下移动，大分子以较快的速度流过凝胶柱，小分子以较慢的速度流过凝胶柱。 凝胶过滤色谱原理图 凝胶过滤色谱原理 3.6.2、凝胶过滤（Gel Filtration） ?分配系数（Kd）衡量各组分的流出顺序， Kd=(Ve-Vo)/Vi Ve—某一组分从加进柱到流出液中该组分出现高峰时，所需的洗脱液体积。 Vo—柱内凝胶颗粒之间空隙的体积。（外水体积） Vi—柱内凝胶颗粒内部各微孔体积的总和。（内水体积） Kd=0，Ve=Vo 该组分完全不进入凝胶颗粒微孔。 Kd=1 Ve=Vo+Vi 该组分可进出全部凝胶颗粒微孔。 常用的凝胶有： （1）葡聚糖凝胶，是以葡聚糖（葡萄糖通过α-1,6糖苷键结合而成的线形高分子）为单体，以1，2-环氧氯丙烷为交联剂，聚合而成的高分子聚合物。商品名Sephadex，根据交联度的不同，凝胶有G-10,15,25,50,75,100,150,200共8种型号。 具有大量羟基，亲水性好，良好的化学稳定性和热稳定性，但避免高离子强度变化会造成凝胶体积收缩。 一种较新的葡聚糖凝胶——Sephacryl，是葡聚糖与甲叉双丙烯酰胺交联而成，其优点：分离范围很大，耐高温，化学和机械稳定性高，比Sephadex性能优越。 （2）聚丙烯酰胺凝胶，以丙烯酰胺为单体，以甲叉双丙烯酰胺为交联剂共聚形成。 商品名Bio-Gel P，化学稳定性好，强度高，但应避免浓酸、浓碱的作用。 （3）琼脂糖凝胶，由D-半乳糖和3，6-脱水L-半乳糖残基交替组成。 瑞典产品Sepharos 美国产为Bio-gel A 特点：多孔、取代基团多，分离范围大，在pH4.0-9.0稳定。 通常在酶的分离时，加入的酶量为凝胶床的10%左右，最多不超过30%。 8种葡聚糖凝胶Sephadex分子量分级范围 不同型号聚丙烯酰胺凝胶（Bio-GelP）分子量分离范围 凝胶过滤纯化系统仪器 凝胶过滤色谱测定蛋白质分子量 3.6.3、离子交换色谱 利用各种蛋白组分荷电性和荷电量的不同，导致蛋白各组分与离子交换剂上可解离基团的离子亲和力不同，而使不同物质分离的方法。 由于酶具有两性电解质的性质，当pHpI时，酶分子带负电荷，使用阴离子交换树脂； 当pHpI时，酶分子带正电荷，使用阳离子交换树脂。 如阳离子交换树脂 -O-CH2-COO--H++Pro+ -O-CH2-COO-(Pro)++H+ 阴离子交换树脂 -O-C2H4-N+H(C2H5)OH-+P