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常用分子生物学技术的原理及应用课件
1
第二十二章
常用分子生物学技术的
原理及应用
The Popular Technology in Molecular Biology:Principle
and Application
2
第 一 节分子杂交与印迹技术Molecular Hybridization Blotting Technology
3
核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization )
在DNA复性过程中,如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中,或把DNA与RNA放在一起,只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系,就可以在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex) 。
一、分子杂交与印迹技术的原理
4
复性
RNA
DNA
5
(一)印渍技术 Blotting
首先由Edwen Southern在1975年提出。
Blotting即“印渍”,指将存在于凝胶中的生物大分子转移(印渍)到固定化介质是病加以检测分析的技术,目前广泛应用于DNA、RNA、和蛋白质的检测
6
探针技术 probe
将一小段已知序列的核酸片段用放射性同位素、生物素或荧光染料对它的末端或全链进行进行标记,称为“探针”然后用于分子杂交,杂交后通过放射自显影、荧光检测或显色技术,使杂交区带显现出来
7
二、印渍技术的类别及应用
DNA印迹技术 Southern blotting
RNA印迹技术 Northern blotting
蛋白质印迹技术 Western blotting
斑点印迹 Dot blotting
原位杂交 in situ hybridization
DNA点阵 DNA array
DNA芯片技术 DNA chip
8
(一)DNA印迹技术 Southern blotting
又称为Southern杂交,即DNA-DNA杂交分析。是研究DNA图谱的基本技术,主要用于基因组DNA的分析,如在基因组中特异基因的定位及检测等,亦可用于分析重组质粒和噬菌体。 在遗传诊断DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。
9
基本方法
将DNA标本用限制性内切酶消化后,经琼脂糖凝胶电泳分离各酶解片段;
经碱变性,Tris缓冲液中和,高盐下通过毛吸作用将DNA从凝胶中转印至硝酸纤维素滤膜上,烘干固定,凝胶中DNA片段的相对位置在DNA片段转移到滤膜的过程中继续保持着。
附着在滤膜上的DNA与32P标记的探针杂交,利用放射自显影术确定探针互补的每条DNA带的位置,确定在众多酶解产物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。
10
Paper Towels
Southern Blotting
tissue
SDS
蛋白酶K
酚/氯仿
无水乙醇
离心
11
(二)RNA印渍技术 Northern blotting
又称为Northern杂交,即RNA-DNA杂交分析。是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。
主要用于检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA的表达水平以及比较不同组织和细胞的同一基因的表达情况。
12
(三)蛋白质印渍技术Western blotting
又称为Western杂交,或免疫印渍技术,即利用抗原-抗体反应,检测转移到硝酸纤维素膜上的特异性蛋白质。
应用:用于检测样品中特异性蛋白质的存在、细胞中特异蛋白质的半定量分析以及蛋白质分子的相互作用研究等。
13
三种印迹技术的比较
14
(一)DNA印迹技术 (Southern blotting)
用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。
(二)RNA印迹技术 (Northern blotting)
用于RNA的定性定量分析。
(三)蛋白质的印迹分析 (Western blotting)
用于蛋白质定性定量及相互作用研究。
15
斑点印迹Dot blotting
斑点杂交法是不经过电泳,而将被检标本直接点到膜上,烘烤固定,用于杂交。这种方法耗时短,可做半定量分析,一张膜上可同时检测多个样品。
16
原位杂交in situ hybridization
即组织原位杂交,指组织切片或细胞涂片直接用于杂交分析。先经适当处理,使细胞通透性增加,让探针进入细胞内与DNA或RNA杂交。因此原位杂交可以确定探针的互补序列在胞内的空间位置,这一点具有重要的生物学和病理学意义。
17
第 二 节 聚 合 酶 链 反 应Polymerase Chain Reaction
18
PCR技术 polymerase chain reaction
PCR即
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