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茎直黄芪中苦马豆素提取工艺研究 　　摘要：以茎直黄芪（Astragalus strictus）为原料，通过单因素试验、正交试验和方差分析确定了苦马豆素的酶法提取工艺条件，并用气相色谱法测定了提取物中苦马豆素的含量。结果表明，优化后的茎直黄芪中苦马豆素最佳提取条件为，粉碎目数80目、料液比1∶40、纤维素酶添加量3.5%、酶解时间3.0 h。在此提取条件下，苦马豆素的提取率可达到39.41 mg/kg。该法快速、高效、方便、节能，有利于茎直黄芪中苦马豆素的提取。 　　关键词：茎直黄芪（Astragalus strictus）；苦马豆素；纤维素酶；气相色谱法 　　中图分类号：S567.7 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）08-1886-03 　　茎直黄芪（Astragalus strictus）为豆科黄芪属多年生植物，在西藏各地均有分布，每年在其密集生长的牧区都有大批的家畜中毒死亡，是中国西藏牧区危害最严重的毒草之一[1，2]。茎直黄芪中的主要有毒成分为苦马豆素，是一种大极性的吲哚里西丁类生物碱，水溶性极好，经动物肠道吸收后，在溶酶体酸性环境下解离，因其阳离子结构与Α-甘露糖阳离子结构近似，使得竞争结合Α-甘露糖甘酶，不仅抑制了Α-甘露糖甘酶酶活性，同时造成溶酶体内甘露糖不能代谢而蓄积，导致细胞特别是神经细胞的空泡性，从而引起动物中毒[3]。苦马豆素同时还具有抗肿瘤活性，能特异性地抑制高尔基氏体Α-甘露糖甘酶Ⅱ的活性，同时抑制了肿瘤细胞表面糖蛋白的表达，从而抑制肿瘤的生长和转移，并能缓解化疗和放疗中产生的骨髓抑制作用[4]。 　　目前苦马豆素的提取主要采用热回流法、索氏提取法、超声波提取的常规醇提法[5]。近年来，酶的用途越来越广泛，涉及的领域也越来越多，生物酶解提取法是利用酶反应的高度专一性，将细胞壁的水解或者降解，破坏细胞壁，从而提高有效成分的提取率。目前，中药提取方面研究较多的酶是纤维素酶[6，7]，大部分中药材的细胞壁主要是由纤维素类物质构成的，植物的有效成分往往包裹在细胞内部，用纤维素酶酶解可以使植物细胞壁破坏，有利于有效成分的提取。由于酶制剂在常温、 常压条件下就能起催化作用， 能有效地提高植物药中有效成分的含量。目前关于酶解法提取苦马豆素鲜有报道。 　　本试验为了进一步提高苦马豆素的提取率、降低生产成本，采用纤维素酶对茎直黄芪进行酶解提取苦马豆素， 取得了良好的效果，为酶法提取苦马豆素提供了理论依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 材料与试剂 茎直黄芪（西藏自治区农牧科学院提供）；苦马豆素标准品（购自西安杨凌天力生物技术有限公司，纯度为98.4%）；双（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA）+三甲基氯硅烷（TMCS）（硅烷化试剂，百灵威公司产品）；纤维素酶（工业级，140万活性单位）；甲醇、氯仿、正丁醇、吡啶、D-甘露醇等均为分析纯。 　　1.1.2 仪器 气相色谱仪（VARIAN CP-3380）；色谱柱为瓦里安毛细色谱柱CP-SIL5 CB（15M×0.25 mm×0.33 mm）；KH7200DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；RE-5203型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。 　　1.2 方法 　　1.2.1 样品处理 将茎直黄芪自然条件下户外晾干，粉碎后过40～80目筛，备用。精密称取适量茎直黄芪干草粉于烧瓶中，加入一定量pH 4.5的酸水，添加一定量的纤维素酶，在50 ℃下进行酶解反应。反应后将提取液煮沸2 min，过滤，滤液浓缩成浸膏，甲醇溶解，过滤，滤液浓缩成浸膏，用碱性正丁醇溶解浸膏，过滤，回收正丁醇，并用吡啶溶解残留物作为供试样品，准确量取吡啶溶液上清液100 μL，分别加入10 μL D-甘露醇标准品溶液和100 μL BSTFA+TMCS（99∶1），室温条件下干燥器中衍生反应1 h。进行GC分析，记录色谱峰面积比较分析。每组试验重复3次，取平均值。 　　1.2.2 色谱条件 进样口温度为260 ℃，火焰离子化检测器（FID）温度为260 ℃，柱子初始温度为150 ℃，程序升温5 ℃/min（8 min），再程序升温 　　30 ℃/min（2 min），气为高纯氮气，流速为1 mL/min，定量方法为内标工作曲线法。 　　1.2.3 标准溶液的配置 准确称取D-甘露醇2 mg，溶于10 mL吡啶中，配成质量浓度为0.2 g/L的溶液。准确称取1 mg苦马豆素标准品，用吡啶配成质量浓度为0.1 g/L的标准溶液，并将其分别稀释为0.05 g/L、0.025 g/L、0.012 5 g/L、0.006 25 g/L、0.003 125 g/L和0.001 562 5 g/L的标准溶液。准确量取标准溶液10