产脂肪酶真菌的筛选.docVIP

脂肪酶产生细菌的筛选 （河北农业大学 生命科学学院 微生物与生化药学 河北 保定 071001） 摘要：从富含油脂的土壤中寻找高产脂肪酶的真菌，以期为扩大脂肪酶的菌源提供材料。本试验从保定市炼油厂附近土样中，经富集培养、平板筛选得到22 株脂肪酶产生菌株，通过复筛得到 1 株脂肪酶活力较高真菌。为脂肪酶产生菌以及脂肪酶的工业化生产与应用奠定了基础。 关键词：脂肪酶； 筛选；真菌 Abstract： The study aimed to seek for the fungi with high yield of lipase from the greasy soil，so as to provide the material for expanding the fungi source of lipase. 22 strains of fungi producing lipase were isolated by enrichment culture and flat screening methods in soil samples collected from the refinery of Baoding． A stain with higher activity of producing lipase was isolated by re-screening methods.The study laid a foundation for lipase producing bacteria and industrial production and application of lipase to some extent． Key words:Lipase; Screening; fungi 前言 脂肪酶( Lipase，EC.3.1.1.3，甘油三酯水解酶) ，可在油水界面催化甘油三酯形成甘油二酯、甘油单酯或甘油及游离脂肪酸［1］。微生物脂肪酶比动物脂肪酶酶解作用的 pH 和温度范围更宽，便于工业化生产获得高纯度酶制剂［2］。脂肪酶在微生物界分布很广，据不完全统计，目前已有 65 个属的微生物能够产生脂肪酶［3］。随着对微生物脂肪酶研究的深入，已发现多种具有不同的酶学性质和底物特异性的微生物脂肪酶，其在水解、酯化、转酯及酯类手性合成等反应中都表现出较好的应用前景［4］。 就微生物脂肪酶而言，虽然在产酶菌株选育、培养条件、酶的性质及工业应用上已进行了多年研究，但由于脂肪酶的结构及性质的多样性、酶的不稳定性、底物的水不溶性、酶的来源不足、提纯困难和应用范围不广泛等问题，脂肪酶的研究进展及工业应用与蛋白酶、淀粉酶相比要慢得多，窄得多［5］。国内，脂肪酶的研究与开发曾被连续列为 3 个五年攻关项目，但目前对脂肪酶制剂的需求仍主要依赖进口［6］。因此，该研究拟通过初筛和复筛从富含油脂的土壤中寻找高产脂肪酶的真菌，以期为扩大脂肪酶的菌源提供材料。 1 材料与方法 1.1 样 品 1.1.1供试土样 8个土样分别采自保定市周边植物油厂、餐厅、菜市场、屠宰场等周围富含油脂的土壤。 1.1.2 试 剂 聚乙烯醇（PVA，聚合度1750±50）购自天津市化学试剂三厂；橄榄油购自上海医药（集团）上海化学试剂公司；其他生化试剂或化学试剂均为进口或国产分析纯。 1.1.3 培养基 富集培养基：每升含0.5g (NH4)2SO4，0.1g NH4NO3，0.1g NaCl，0.1g MgSO4·7H2O，0.5g K2HPO4，0.1g FeSO4·7H2O，10mL橄榄油，用0.1mol/L NaOH 调pH8.0。 初筛培养基：每升含0.5g (NH4)2SO4，0.1gNH4NO3，0.1gNaCl，0.1g MgSO4·7H2O，0.5gK2HPO4，0.1g FeSO4·7H2O，20g琼脂，121℃灭菌20 min后，于60℃左右加含0.2%溴甲酚紫的聚乙烯醇橄榄油乳化液12mL。用0.1mol/LNaOH调pH8.0。 PDA 培养基： 马铃薯 200.0 g /L，蔗糖 20.0 g /L，琼脂20.0 g /L。PDB 培养基不添加琼脂。 发酵培养基：每升含1.0g (NH4)2SO4，1.0gMgSO4·7H2O，1.0g NaH2PO4，2.0g K2HPO4，10mL橄榄油，20g黄豆粉，10g蔗糖。用0.1mol/LNaOH调pH8.0。 种子培养基：每升含5.0g (NH4)2SO4，1.0g K2HPO4，0.5g MgSO4·7H2O，20g 葡萄糖，25g蛋白胨，10mL橄榄油。用0.1mol/L NaOH调pH8.0。 1.2 试验方法 1.2.1 产脂肪酶菌株的筛选 1.2.1.1 富集培养 将采集的土样 10