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蓝莓菌根真菌液体培养条件正交试验优化 　　摘要：采用正交试验设计研究不同温度、pH、不同碳源和氮源等因子对一株蓝莓菌根真菌生长的影响。结果表明，4种因子对菌根真菌生长的影响程度依次为pH、氮源、温度和碳源，其中，pH对菌根真菌的生长有显著影响。菌根真菌最适宜液体培养条件为pH 6，温度30 ℃，碳源为淀粉、氮源为蛋白胨的改良MMN培养基。 　　关键词：蓝莓（Vaccinium uliginosum L.）；菌根菌；培养条件；温度；pH；碳源；氮源 　　中图分类号：Q93-335 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）10-2268-02 　　蓝莓（Vaccinium uliginosum L.）属杜鹃花科（Ericaceae）越桔属（Vaccinium）植物，其果实除含有一般水果中的有机酸、维生素和矿物质外，还含有丰富的花青素、不饱和脂肪酸、鞣花酸及微量元素钾、钙、锌、铁等，VE和B族维生素的含量也比较高[1]。据美国农业部人类营养研究中心的研究报道，蓝莓的抗氧化作用列各种水果、蔬菜之首。它是抗癌、预防血栓及动脉硬化、抗泌尿系统感染、预防心脏疾病和延缓衰老的非常可靠的保健食品，被国际粮农组织列为人类五大健康食品之一[2]。 　　蓝莓为浅根系植物，根系不发达，无根毛，根纤细，呈纤维状，主要分布在浅土层。蓝莓根系一般水平分布范围在树冠的投影区域内，深度为30～45 cm，因此蓝莓对土壤条件要求严格，其中土壤pH、土壤水分、透气性、排水性等条件对蓝莓生长有很大影响，不适宜的土壤条件常导致蓝莓栽培失败，蓝莓通常在有机质含量高、土壤通气性良好和水分充足而稳定的酸性沙质土壤中生长良好[3，4]。但在自然状态下，蓝莓根系与菌根真菌共生形成菌根。目前已发现浸染蓝莓的菌根真菌有10余种。值得注意的是，几乎所有蓝莓的细根都有内生菌根真菌的寄生，从而解决了蓝莓根系由于没有根毛造成的对水分及养分吸收能力下降的问题。菌根真菌的侵染对蓝莓的生长发育及养分吸收起着重要作用[5-8]。 　　菌根真菌菌株MF002[晶粒鬼伞（Coprinus micaceus）MF002]属于伞菌目、鬼伞科、鬼伞属，由辽宁省农业科学院微生物中心从野生蓝莓中分离筛选。接种菌根真菌菌株MF002可以显著促进蓝莓生长、增加蓝莓鲜果的花青素、鞣花酸含量。但目前关于蓝莓菌根真菌的纯培养研究尚少。因此，采用正交试验设计研究不同因子对分离自蓝莓根部的菌根真菌菌株MF002液体培养的影响，旨在探索适宜于其生长的最佳条件，以期为菌丝体的扩繁和菌剂生产奠定基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 供试菌种 供试菌株MF002[晶粒鬼伞（Coprinus micaceus）MF002]，由辽宁省农业科学院微生物中心提供，分离自野生蓝莓根内。 　　1.1.2 固体基础培养基 改良MMN培养基。CaCl2·2H2O 0.05 g，麦芽粉3 g，NaCl 0.025 g，葡萄糖10g，KH2PO4 0.5 g，牛肉膏蛋白胨15 g，（NH4）2HPO4 0.25 g，维生素B1 0.1mg，MgSO4·7H2O 0.15 g， FeCl3（1%溶液）1.2 mL，琼脂20g，去离子水1 000 mL。 　　1.2.3 液体基础培养基 按照正交试验设计，将改良MMN培养基中的碳源（葡萄糖+麦芽汁）分别用20 g/L的葡萄糖、麦芽糖、乳糖和可溶性淀粉替代，用0.25 g/L的无机氮源[（NH4）2HPO4、NH4NO3、KNO3]和3 g/L的有机氮源（蛋白胨）替代培养基中的氮源[（NH4）2HPO4+麦芽汁]，制成液体基础培养基。 　　1.2 方法 　　1.2.1 菌种活化 将菌株MF002接种于改良的MMN固体培养基上，28 ℃下培养4 d，备用。 　　1.2.2 摇床培养 将配制好的液体培养基分装到100 mL三角瓶中，每瓶50 mL，在121 ℃、0.05 MPa条件下灭菌20 min，冷却后每瓶定量接种1块直径为7 mm的活化菌饼，每处理3次重复。150 r/min条件下培养7 d。 　　1.2.3 菌丝体干重的测量 将三角瓶中发酵液及菌丝体过滤，于80 ℃烘箱中烘干，记录菌丝体干重。 　　1.2.4 试验设计 采用L9（34）正交试验设计，试验因素与水平见表1。 　　1.2.5 统计方法 培养7d后进行生物量测定。试验数据用SPSS统计分析软件和Microsoft excel 进行统计分析。 　　2 结果与分析 　　试验结果（表2）表明，9个处理的菌丝体干重平均值存在差异，在处理6的培养条件下，MF002的菌丝体干重显著高于其他处理，为0.117 4 g/（50 mL）。由此得出菌株MF002的最佳液体培养条件为pH