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5.4 分离优化色谱分离度与分离性能 在这一部分您将学习: 什么因素影响样品组分之间的分离度. 容量因子 (保留因子)、选择性和柱效如何影响分离度. 如何提高分离度. 色谱工作者关心的基本问题 - 色谱峰之间的分离度 分离度值 第一个和第二个峰之间的分离度计算 等梯度洗脱的基本分离度公式 影响分离度的因素 容量因子- 分离度 容量因子对分离度的影响 容量因子 - 流动相组成 选择性 影响选择性的参数 通过改变键合相改善小麦蛋白质中 ?-麦醇溶蛋白的分离度 改变色谱柱以改变选择性 改变固定相 色谱柱温度对分离度的影响 调节色谱柱温度 通过改变温度改善分离度 柱效 计算柱效 计算柱效 扩散 - 流速变化 扩散 - 纵向扩散 扩散 - 传质 扩散 - 各项的贡献 典型的流速值 在传统柱上采用增加流速的方法提高分析速度 柱外体积的影响 所需分离度与柱长匹配 峰对称性 提高分离度 练习 练习 练习 Analytical Education Center BLC 2-10 Time in Minutes 增大 k 增加选择性 提高柱效 t0 初始 改变 ? 增加 ? 增加 ? t 请指出每种情况改变了分离度 公式中的哪个参数: N, k’, or ?. 在每种情况下改变了什么参数, 如 流动相组成，使初始分离得到了改善? 分离条件：色谱柱：100 x 4.6 mm i.d., 10 um, C-8 . 流动相： 70/30 异丙醇（IPA）/水 流速：2 mL/min. 提高分离度的最后手段. 0 time mAU 1. 列出提高样品组分保留作用的三种方法. 2. 列出减小色谱峰宽的四种方法. 3. 下面参数中哪些影响柱效? 洗脱强度 流动相黏度 固定相的颗粒度 柱长 色谱柱温度 柱外体积 From an initial separation, improving N sharpens peaks, same retention time; primarily controlled by column length and particle size, improving k* means moving peaks to longer or shorter retention times; primarily controlled by the mobile phase and temperature; figure shows band pair with less retention or more retention by changing % organic in the mobile phase; improving a* means improving selectivity, or moving peaks closer or farther away from each other; primarily controlled by bonded phase, also mobile phase and temperature Higher temperature does not always improve resolution. This is because it changes selectivity, and the direction (i.e. whether peaks will move toward or apart from each other) of selectivity is not predictable. Note that there is a temperature where cytochrome C and insulin cannot be separated, but can be separated above or below the temperature. This slide shows the use of changing bonded phases to improve a*. Gradients were optimized for each phase using initial scouting runs and Dry Lab software. The cyano column shows a number of resolution improvements, such as improved separation of L6/L7 and impurities between L1 and L2, and after L8. Overall, the best separation was o