胡萝卜素分离实验.docVIP

有机化学实验设计 β-胡萝卜素和番茄红素的提取分离与测定 设计者：殷晓杰 学号：2009013452 班级生技093 β-胡萝卜素和番茄红素的提取分离与测定 一．实验目的 1.掌握从番茄中提取β-胡萝卜素和番茄红素的原理和方法； 2.巩固高效液相色谱分离、检测有机化合物的实验技术； 3.学会用分光光度计法测定β-胡萝卜素和番茄红素的方法。 二．实验原理 β-胡萝卜素和番茄红素分子中的碳骨架是有8个异戊二烯单位连接而成的四萜类化合物。类异戊二烯化合物统称为类胡萝卜素。β-胡萝卜素和番茄红素是研究的比较清楚的两种具有抗癌功效的类胡萝卜素。它们的分子式如下： 从上式可以看出，β-胡萝卜素和番茄红素是互为同分异构体，且都有一个较长的π-π共轭体系，能吸收不同波长的可见光。β-胡萝卜素和番茄红素的分子式均为C40H56,相对分子质量均为536.85。β-胡萝卜素和番茄红素都含有疏水的长链，含有不饱和碳氢双键，故可以溶于乙醚、石油醚、丙酮、氯仿等有机溶剂。有关文献表明，用氯仿去溶解提取类胡萝卜素的效果是最好的。 胡萝卜素是最早发现的一个多烯色素，广泛的存在于植物的花果、和叶子中。胡萝卜素在人和动物体内具有重要的生理功能，是人和动物所必需营养物质。番茄红素在成熟的植物果实中含量最高，其中含量最高的是番茄。番茄红素具有在防止细胞癌变、活化细胞等方面有突出贡献。正是由于具有以上的功能，使得胡萝卜素和番茄红素得到了深入的研究。目前类胡萝卜素的提取有利用植物干制品直接粉碎法、有机溶剂侵提法、超临界萃取法、酶反应法等。此外，利用生物育种中的诱导合成和微生物发酵也能很好的得到类胡萝卜素。本次实验中，采取的是利用有机物提取的方法。 类胡萝卜素的分离可以利用色谱来实现。如：纸色谱、柱色谱、薄层色谱、柱色谱、高效液相色谱、大孔吸附色谱等。本实验采用高效液相色谱法来实现类胡萝卜的分离。 类胡萝卜的鉴定可以利用β-胡萝卜素和番茄红素在可见光下有不同的吸收而利用分光光度法来完成。 三．实验仪器与试剂 仪器：研钵 量筒 胶头滴管 滴瓶 25ml容量瓶 层析缸 滤纸SPD—10AVP高效液相色谱仪 721型分光光度计 材料和试剂：丙酮溶液 石油醚：丙酮（3:2）（体积比） 新鲜番茄 四． 内容与步骤 1.类胡萝卜素的提取即样品的获得 （1）准确称取坚熟期的番茄果实0.5g，置于干净的干燥的研钵中，研磨充分后加入适量的丙酮溶液，多次洗提至无色。 （2）将研磨充分的液体转移到25ml容量瓶中，用丙酮多次洗涤研钵和研钵锤，将洗涤液转移到容量瓶中。 （3）将混合液定容到25ml，混匀，备用。 2.类胡萝卜素的分离 法一高效液相色谱法 传统的类胡萝卜素液相色谱分离用的是二氯甲烷作为流动相，对柱体材料的伤害很大，严重影响了色谱中的使用寿命。这里，用国际胡萝卜素协会提出的方法：以乙腈和水(9：1，v／v)为流动相A，以乙酸乙酯为流动相B，进行梯度洗脱，以避免使用二氯甲烷做流动相。本实验采用SPD—10AVP高效液相色谱仪进行检测，色谱条件：色谱柱为C18 (5μm，4.6m×250 mn)，柱温为室温，进样量为15μL，流速为1.2mL／min。 （1）将上述得到的类胡萝卜素样品溶液用．4μl的微孔滤膜过滤,收集滤液。 （2）取15μl滤液通过色谱柱，在500nm下检测，流速1.2ml/min,洗脱时间30min流动相梯度A为乙腈和水(97：3，v／v)，流动相梯度B为乙酸乙酯。 （3）分别收集流动相为A和B时的流出液，备用。 法二大孔吸附色谱法 β-胡萝卜素和番茄红素都含有长的非极性基团，由于大孔吸附树脂对非极性的化台物具有良好的吸附性能，且吸附作用随着被吸附分子疏水性能的增加而增加，故可以采用大孔吸附树脂来分离β-胡萝卜素和番茄红素。本实验拟采用X5—树脂。 （1）吸附树脂的预处理：大孔吸附树脂用乙醇充分浸泡溶胀，然后用蒸馏水洗涤至无混浊现象，在60摄氏度下真空干燥，备用。 （2）将一定量的类胡萝卜素溶液转移到250ml锥形瓶，加入1g树脂，在水浴振荡器上25摄氏度振荡吸附至平衡。 （3）平衡后，取出树脂，分别用石油醚和石油醚：丙酮=3:2的混合液解吸，收集解吸液，备用。 3.类胡萝卜素的检测 对前面得到的类胡萝卜素以及高效液相色谱得到的样品进行纸层析。展开剂为石油醚：丙酮=3:2。由于样品自身都有颜色，股不需要用到显色剂。层析分离完成后，观察斑点位置，计算各斑点的Rf值，明确各斑点归属。 4.类胡萝卜素的鉴定 由于β-胡萝卜素和番茄红素在可见光下有不同的吸收峰，根据这一点可以很好的鉴定两者。将用高效色谱分析得到的两个样品用丙酮稀释到仪器测量范围，然后用721型分光光度计分别在420~520nm范围内每个10nm测定他们的吸光度A，并作出A—λ曲线。找