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* 第十章 单基因病致病基因的鉴定 南方医科大学基础医学院医学遗传学教研室 商璇 副教授，教学秘书，Ph.Dshang80@smu.edu.cn * 本章主要内容: 功能克隆 定位克隆 基于高通量测序技术的致病基因的鉴定 每一片代表一个基因，有规律的组合在一起形成一条染色体 * * * * * 功能克隆：从蛋白质着手进行基因克隆的策略。 定位克隆：在蛋白质产物未知的情况下进行基因克隆的策略。 蛋白 酶消化、分离 氨基酸序列测定 设计合成寡核苷酸 筛选cDNA文库 不同多肽片段 家系资料 连锁分析 获得差异片段 染色体异常 筛选cDNA文库 克隆全长基因 精细定位 消减克隆 * 第一节 功能克隆 * 通过基因的功能（编码蛋白）而不依赖定位的信息来分离基因的策略 第一个疾病致病基因通过此策略发现 范例：镰状细胞贫血的β-珠蛋白基因 苯丙酮尿症的苯丙氨酸羟化酶基因 流程示意图 * * 甲 型 血 友 病 遗传方式：XR 发病率：1/10,000（男） 病因：FⅧ基因遗传性缺陷 (缺失、点突变、插入、重复、倒位) ? 基因定位：Xq28 ? 基因全长186kb，含26个外显子 ? 临床表现：外伤后出血不止，关节血肿 * ☆ FⅧ因子基因的功能克隆 功能克隆是从蛋白质着手进行基因克隆的策略。 Ⅷ因子 多肽 不同多肽片段 蛋白酶消化 分离 氨基酸序列测定 设计合成寡核苷酸 筛选cDNA文库 * 通过动物模型鉴定疾病基因 * * 第二节 定位克隆 * 基于染色体异常的基因定位 连锁分析 确定致病基因 * 基于染色体异常的基因定位 * 连锁分析 * 确定致病基因 突变筛查：在家系中该突变与表型共分离是最主要的证据 表型拯救：有些导致疾病的突变通常引起基因功能的丧失，而且其表型是可逆的。如果从一个患者的细胞中能够发现基因突变的表型，我们就可以检测转染了候选基因野生型等位基因的表达载体是否能够“拯救”突变并恢复正常的表型 建立疾病的小鼠模型：如果能够在某一家系中确定一个致病基因，但又无法利用更多的无关患者来验证，通过构建小鼠模型来验证。对于功能丧失性突变导致的表型可以通过制作基因敲除（knock-out）小鼠。对于功能获得性突变导致的表型或者突变效应不清楚的表型，可以制作突变基因敲入（knock-in）模型 * * Duchenne型肌营养不良 （ Duchenne muscular dystrophy, DMD） 遗传方式： XR 发病率：1/3400（男） 临床表现：双下肢肌无力、Gower征、腓肠肌假性肥大、进行性肌萎缩（一般≤20岁）。 病因：DMD基因突变，→抗肌萎缩蛋白（dystrophin）↓。 基因定位：Xp21.23，全长2,400kb，含79个外显子，是已知最大的致病基因。 * Gower综合征 * ☆ DMD基因的定位克隆 定位克隆是在蛋白质产物未知的情况下进行基因克隆的策略。 家系资料 精细定位 消减克隆 连锁分析 获得差异片段 染色体异常 筛选cDNA文库 克隆全长 第三节基于高通量测序技术的致病基因的鉴定 * 2005年问世的高通量测序技术是测序技术发展历程的一个里程碑，使得疾病的研究策略发生了重大转变。 高通量测序技术的突出优势是测序速度快和测序成本大幅度降低。 NGS技术策略 全基因组测序 全外显子组测序 目标区域测序 疾病相关基因平行测序 * NGS技术在单基因遗传病致病基因鉴定中的策略 基于序列捕获技术，研究者可以在全基因组筛选的基础上对特定区域进行更深层次的研究 由于目标区域缩小，在获得足量目标区域基因变异信息的前提下，样品的测序成本也会大幅降低 * 单基因病家系致病基因鉴定 * 单基因病散发病例致病基因鉴定 * *