第3章 微生物细胞的破碎技术 2005.06.docVIP

第3章 微生物细胞的破碎 知识点：细胞壁的组成和结构，微生物细胞的破碎技术，破碎率的测定。 重点：工业生产中常用的几种细胞破碎方法的原理，操作过程常用设备，并能就实际生产情况予以合理的选择。 难点：常用破碎方法的合理选用。 一．细胞的破碎技术概述 采用微生物发酵或动植物细胞培养时，如果目标生化物质为胞外产物，如霉菌产生的糖化酶等，提取过程较简单，只需直接进行固-液分离，获得澄清的滤液，再进行分离纯化操作；如果目标生化物质为胞内产物，如碱性磷酸酶等胞内酶、部分外源基因表达产物或植物细胞产物等，则要对菌体或细胞进行适当的处理，选择性地释放目标生化物质到液相中，然后进行固-液分离去除细胞及其碎片，再进行目标生化物质的分离纯化。 由于细胞的结构根据细胞种类而异，动物、植物和微生物细胞的结构差异很大。动物细胞、嗜盐菌和支原体没有细胞壁，易于破碎。植物细胞和微生物细胞有一层坚固的细胞壁，破碎困难，需用较强烈的破碎方法。因此，本课程主要介绍微生物细胞的破碎技术。 所谓的微生物细胞破碎就是使微生物的细胞壁或细胞膜受到不同程度的破坏或破碎，增大胞膜通透性，使胞内产物获得最大程度的释放,便于所需的生化物质的提取和分离的一种操作。本质上这是一种增溶作用，其主要阻力来自于各种微生物细胞壁的结构和组成的差异。 由于各种微生物细胞壁的结构和组成的差异导致细胞破碎的难易程度不同。因此，了解微生物细胞壁结构和强度对判断细胞破碎的难易程度和选择合适的细胞破碎方法有着十分重要的意义。表1所示为各种微生物细胞壁的结构和组成。 表1 各种微生物细胞壁的结构与组成 微生物 革兰氏阳性细菌 革兰氏阴性细菌 酵母菌 霉菌 壁厚/nm 20～80 10～13 100～300 100～250 层次 单层 多层 多层 多层 主要组成 肽聚糖（40%～90%） 酯多糖（1%～4%） 多糖 细胞酸 蛋白质 肽聚糖（5%～10%） 酯多糖（11%～22%） 酯蛋白 磷脂 蛋白质 葡聚糖（30%～40%） 甘露聚糖（30%） 蛋白质（6%～8%） 脂类（8%～14%） ②测定释放的蛋白质量或酶的活力：细胞破碎后，测定悬浮液中细胞内含物的增量来估算破碎率。通常将破碎后的细胞悬浮液离、测定上清液中蛋白质的含量或酶的活力，并与100%破碎所获得的标准数值直接比较。细胞破碎和产物溶解过程非常复杂，很难完全定量描述。 四．常用破碎技术 细胞破碎的目的是选择性释出胞内产物，按照是否存在外加作用力可分为机械法和非机械法两大类（表1）。机械破碎中细胞所受的机械作用力主要有压缩力和剪切力，非机械破碎主要利用化学或生化试剂(酶)改变细胞壁或细胞膜的结构而释放胞内物质。 表1 机械破碎法与非机械法比较[2] 比较项目 机械法 非机械法 破碎机理 切碎细胞 溶解局部壁膜 破片大小 碎片细小 细胞碎片较大 内含物释放 全 部 部 分 粘 度 高（核酸多） 低（核酸少） 时间、效率 时间短、效率高 时间长、效率低 设 备 需专用设备 不需专用设备 通用性 强 差 经 济 成本低 成本高 应用范围 实验室、工业范围 实验室范围 不管是机械法还是非机械法，各种方法都有自身的局限性。多种破碎方法相结合是一个发展方向。微生物细胞破碎技术的未来发展方向主要集中在如下几个方面： ①多种破碎方法相结合：如机械破碎前，先用硫醇处理酵母细胞，利用酶活激活糖苷酶，从而去除细胞壁中得的糖，使细胞壁强度减弱，可以大大提高胞内蛋白的收率。如：用溶菌酶预处理面包酵母，然后采用高压匀浆机，在9.5 MPa压力下匀浆4次，总破碎率接近100％，而单独采用高压匀浆法，同样条件下破碎率只有32％。 ②与上游过程相结合：菌体破碎的难易程度与发酵培养过程的条件息息相关。可通过改变培养基的组成、发酵条件等因素或者利用基因工程方法对菌种进行改造。如：克隆噬菌体溶解基因，表达耐高温产品的基因等。 ③与下游过程相结合：从整体角度考虑细胞的破碎程度，避免因细小碎片无法除净而导致后续的固液分离和纯化过程的难度增大。 表3则列出了细胞破碎一些主要方法，其中高速湿法珠磨法和高压匀浆法已经在工业生产中广泛应用，酶解法和化学溶胞法也大量应用于实验室规模的细胞破碎中，超声破碎法和微波破碎法的实验室研究开发相当活跃。 表3 细胞破碎主要方法[ ] 分类 作用机理 适应性（或选用策略） 机 械 法 高速湿法珠磨 固体剪切作用 可达较高破碎率，可较大规模操作，大分子目的产物易失活，浆液分离困难 高压均浆法 液体剪切作用 可达较高破碎率，可较大规模操作，不适合丝状菌和革兰氏阳性菌 超声破碎法 液体剪切作用 对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧烈，不适合大规模操作 非 机 械 法 酶解法 酶分解作用 具有高度专一性，条件温和