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粘细菌的分离筛选及其应用研究 09生工（2）班 肖军 20090806249 摘要：由于粘细菌自身生长特性的限制，分离纯化的困难和耗时．极大地限制了菌种资源的开发。该文简要介绍了粘细菌的生物生理学特性，探讨了基于纯培养技术筛选粘细菌的常用方法，以及运用宏基因组技术来获得未培养或无子实体克隆菌株的流程，指出了当前在菌种筛选方面存在的主要问题，对进一步的研究开发给出了一些见解，并展望了其在医药、农业、生态环境和工业生产中的应用前景，使粘细菌得到更多研究者的重视，弥补其应用研究的不足。 关键字：粘细菌；分离；纯化；应用；前景 粘细菌(Myxobacteria)是典型的革兰氏阴性菌，属滑动细菌，营养细胞呈杆状柔软，具有独特的信号传递系统和形态发生过程，通过信号的传递和感应聚集形成子实体(FruitingBodies)，可作为研究原核生物多细胞行为和形态发生的重要模式材料。因其代谢产物丰富，作用机制多样等特点，已经成为生物活性次级代谢产物的“微工厂”，越来越受到罔内外研究者的高度关注。但是由于粘细菌自身特性的限制、分离纯化的困难和方法的特殊性使其成为制约研究、开发粘细菌的一个瓶颈，目前已知的粘细菌大多是用传统方法分离的，基于此，笔者对粘细菌常用的筛选方法作一归纳总结，同时探讨了运用宏基因组技术来获得未培养或无子实体粘细菌的流程，此方面国内相关文献报道较少，并展望了其应用前景，为更多的研究人员来开发应用粘细菌提供一种思路和方法，使粘细菌得到应有的重视。 1 特性简介 1．1 生长分布 粘细菌作为土壤中的常见腐生菌．为严格好氧的化能有机营养璎微牛．物，通常撮的土样可以分离出4、5种，一般在温暖十燥富含有机质的土壤中尤为丰富，最适生长温度在30℃左右，主要分布于土壤表层、树皮、腐烂的木材、厩肥和动物粪便上，尤其是草食性动物的粪便、中性或微碱性的土壤、活树树皮以及腐败的植物上。由于枯细菌的粘孢子和子实体有很强的抗逆性，在海洋、酸性泥沼、低氧条件、高渗透压、盐碱等极端条件下也有粘细菌的分布。 1．2系统分类 从细菌分类已确定的粘细菌有12个属，约40个种。根据对底物的利用能力将其划分为两个生理亚群：溶细菌群和溶纤维索群。其中溶纤维素群所包括的种属较少，只有纤维堆囊菌，其余种属归于溶细菌群。目前粘细菌是以其形态特征为主要依据进行划分的，如子实体的结构特征、营养细胞、粘孢子和菌落的形态等，同时辅助于生理生化实验、G+C百分含量、脂肪酸的类型等，近年来分子鉴定的方法也运用其中。 1．3生理生化 粘细菌产生的胞外酶能水解蛋自质、核酸、死菌体和纤维素等多种物质．以氨基酸或小分子肽类提供营养，为特征性菌落的形成创造条件。溶纤维素群采用滤纸来诱导子实体的形成，在生理生化实验中能分解纤维素，其余指标不尽相同，溶细菌群以死的大肠杆菌或酵母菌为诱导物来形成子实体进行富集，各种生理指标不尽相同。同时菌株也可以分泌丰富的胞外黏液多糖，有螳还能产生类胡萝卜素(尤其是叔糖苷类)、原仆啉和黑色素，这些特征也为我们提供了较好的研究方向。 1．4几大性状 粘细菌有几个突出特征：(1)可以通过底物诱导形成子实体。在水琼脂等营养匮乏的培养摹上，细胞聚集堆积形成子实体需要一定的密度依赖性，通常浓度要达到103 cfu／ml以 上，同时生长周期较长，容易被碡菌污染，形成的子实体颜色和形状随菌种而异，但经常是红、黄等鲜艳的颜色；(2)菌体能向体外分泌多糖黏液．将细胞团包埋于黏液中，在液体培养基中分散Ⅲ难，借助于黏液在圃体界面上作滑行运动。町形成薄而扩展的菌落；(3)细胞DNA中含有较高的G+c％(67％一7l％)；(4)町以产生丰富的牛物活性物质，如抗肿瘤哺1、抗凝溶栓蛋白、谷胱甘肽转移酶和乙酰月H碱酯酶的抑制剂|71等，这为寻找新药或新药先导化合物提供了较好的菌种资源。 2筛选方法 2．1 基于纯培养的粘细菌传统筛选方法 由于粘细菌独特的生长特性，使用传统的稀释培养方法来分离纯化已不能凑效。分离纯化粘细菌的主要依据：(I)菌体在特定底物诱导条件F nr聚集形成子实体；(2)在营养匮乏的培养g-上容易形成薄而扩展的菌落，形态各异，有滑动痕迹并分泌黏液；(3)菌体细胞在营养丰富的液体培养基中振荡培养时很难分散，通常在试管中会形成球块状沉淀或薄膜片状。 2．1．1样品预处理 将采集回来的不同环境下的土壤样品室内自然风干后磨成粉末，枯枝败叶类样品磨碎，用时用一定浓度的放线荫酮、制霉菌素或多菌灵。浸泡数小时，以除去一些杂菌，食草动物的粪便也用同样浓度的试剂浸泡后再用高压蒸汽火菌。 2．1．2富集分离：(1)溶细菌群粘细菌的富集：菌体诱导法，在YWCX或EWCX培养基上的菌体交叉点上接种一个适当大小的样品。也可以将活菌体点种于WC