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常用基因分离技术及其在茶学研究中应用 　　摘要：茶是世界上重要的无酒精饮料之一，同时具有很高的保健价值。近年来，在茶树分子生物学的研究领域取得了长足进展，许多功能基因被分离和克隆，对这些基因的研究有助于从分子水平上掌握茶树生物活性物质的代谢调控机制，为茶树品种改良提供新途径。介绍了常用的基因分离技术原理及其在茶学研究中的应用，将有助于从宏观上把握茶树分子生物学研究的现状，为厘清科研思路提供理论依据。 　　关键词：茶学；基因克隆；表型差异克隆 　　中图分类号：S571.1；Q781 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）24-5953-05 　　基因组是生物体遗传信息的携带者和传递者，其中基因是基因组中编码蛋白质的序列，基因的选择性表达对应了生物体生长和发育的不同阶段，揭示了生命活动的内在机理。在农作物育种中，对决定其重要农艺性状的功能基因的研究在遗传改良中具有重要作用，对农作物分子生物学水平的研究具有重大的应用价值。因为转基因作物巨大的经济效益和生态效益，现在国内外的农业生产中都十分重视转基因作物的研究和应用，国内已大量种植转基因的抗虫棉花、大豆等。2009年国家农业部通过了转基因植酸酶玉米和转基因抗虫水稻的生物安全性评价，可用于商业生产。因为茶树是小作物，而且有自交不亲和、生长周期长等特点，所以茶树基因组研究基础比较薄弱。自1994年Takeuchi等[1]报道了第一条茶树基因CHS（查尔酮合成酶）序列以来，取得了较快的发展。如今，NCBI GenBank数据库中已提交的茶树基因编码序列达到197条，其中全长序列占137条；预测的蛋白质序列478条；提交的EST序列达到12 664条。但是到目前为止已提交的基因编码序列中有大量的基因功能未知，重要功能基因仅停留在分离和克隆阶段，很多生物活性物质如儿茶素、茶氨酸的代谢途径尚不清楚。因此，对茶树功能基因的克隆和初步研究将在一段时间内继续成为茶树分子生物学研究的主流，把握其研究现状和相关的技术将为以后的科研工作提供理论依据，具有重要的参考价值。 　　常用的基因克隆方法大致可以分为序列克隆、功能克隆、定位克隆、表型差异克隆和测序??隆5种，下面将分别介绍这几种基因克隆方法的原理及其在茶学研究中的应用。 　　1 序列克隆——根据已知基因部分或全长DNA或RNA序列获得基因 　　1.1 PCR扩增结合RACE技术进行基因克隆 　　当已知目的基因的序列时（比如通过NCBI网站或者他人的文章得知基因序列）， 通常采用PCR 的方法来克隆基因。其原理和方法是：①如果已知全长序列，对照该序列， 设计并合成1对寡核苷酸作引物， 提取所要从中分离基因的茶树染色体DNA （如果提取的是RNA，则首先需要在逆转录酶的作用下合成cDNA 的第一条链）， 然后通过PCR反应得到目的片段，测序后与已知序列进行比对，因为同一条基因在物种内和物种间均存在多态性，因此所得到的序列不一定与已知序列完全相同。②如果只知道序列片段，可以用上述方法先通过PCR技术得到基因片段，然后结合RACE（Rapid-amplification of cDNA ends，RACE）技术得到全长序列。此方法简便、快速， 尤其适于经费不足、分离一些重要基因起步较晚的情况。 　　β-葡萄糖苷酶与茶叶香气物质的形成有关，王让剑等[2]根据GenBank登录的这两种酶蛋白的氨基酸序列设计引物，从龙井43中克隆得到GlUⅠ（β-葡萄糖苷酶Ⅰ）和GlUⅡ（β-葡萄糖苷酶Ⅱ）基因，在大肠杆菌中表达并纯化出了有活性的蛋白，为其在茶叶加工研究以及在其他食品中的应用奠定了基础。类黄酮化合物是具有抗菌、抗氧化等生物活性的一类次级代谢产物， Lin等[3]根据已知的EST序列片段从茶树中克隆得到全长FLS基因，并用原核表达系统获得了有活性的蛋白。α-tubulin（α微管蛋白）是茶树的看家基因，表达量比较稳定，因此可以作为比较基因和蛋白表达水平时的内参，谭振等[4]根据GenBank登录的α-tubulin mRNA全长序列设计了引物，以RT-PCR方法扩增得到茶树α-tubulin基因全长，将扩增产物用原核表达系统表达了重组蛋白，并制备相应的抗体，以期为茶树功能蛋白的Western blot提供内参。陈聪等[5]利用GenBank中公布的茶树PCP （花粉壁蛋白基因）序列设计引物以龙井43为材料，采用PCR法扩增并测定了茶树花粉壁蛋白基因内含子序列，并通过序列分析推测该内含子序列可能对PCP基因的表达起到调控作用。PPO基因（多酚氧化酶）对茶叶的品质有重要影响，Liu等[6]根据已知序列，从宜红早茶树中克隆得到PPO基因，首次用原核系统表达出了有活性的PPO蛋白。Wu等[7]从5个不同的茶树栽培种中克隆出了PPO基因，用