马铃薯组织培养中污染原因及控制措施.docVIP

马铃薯组织培养中污染原因及控制措施 　　【摘 要】组织培养是通过无菌操作分离植物体的一部分，接种到培养基上，在人工控制的条件下进行培养，使其产生完整植株的过程。在整个组织培养过程中，污染是一个普遍存在的现象，污染率高使组培的成本相应增加，甚至造成毁灭性损失。因此，控制污染是组织培养研究及工厂化育苗生产中一个重要环节，也是一套贯穿整个组培过程的技术。 　　【关键词】植物组织培养；无菌操作；污染 　　1.污染的症状和原因 　　真菌性污染主要指霉菌引起的污染。一般接种后3～8d可在培养基中发现各种颜色的菌斑。真菌性污染，一般是由空气污染和瓶口边缘的灰尘和真菌孢子落入器皿中造成的。另外，在湿度太大的季节和培养室内，棉塞也会长出真菌孢子引起大量污染。 　　细菌性污染是指在培养过程中，工作人员使用了未经充分消毒的工具，在培养基表面或材料表面出现黏液状物体、菌落或浑浊的水渍状，有时呈现泡沫发酵状[4]。一般在接种后1～2d即可发现。细菌污染又以芽孢杆菌最普遍、最严重。这种芽孢杆菌能耐一定高温、高压，对消毒剂和紫外线也有一定抗性。常由于高压灭菌不彻底造成的。因此，每次培养基灭菌后，应放在培养室2～3d。看培养基表面和内部无任何细菌痕迹，才能使用。 　　2.影响污染的因素 　　2.1培养基消毒 　　培养基的污染以细菌污染为主，主要表现为：培养基表面出现黏液状物质、菌落或呈浑浊的水渍状甚至泡沫发酵状，其中芽孢杆菌发生最为普遍和严重，呈乳白色。可随培养材料、用具等传播，也可出现在培养基表面，或呈滴形云雾状存在于培养基内。这种菌外包有夹膜，能耐一定的高温、高压，对紫外线有一定的抗性，一般消毒剂也难以杀死[2]。 　　2.2外植体 　　植物组织培养的成败除与培养基的组分有关外，另一个重要因素就是外植体本身，即由植物上切取下来，用以进行离体培养的那部分组织或器官。在继代培养中，一定要严格筛选无污染的外植体。对于某些存在于接种材料内部的内生细菌，由于它潜伏的较深，在外植体的初级培养中不易被发现随着继代次数的增加，菌量慢慢累积发展才在培养基上显现出来，一般的表面消毒方法无法将其消除，会随着材料带入培养过程引起污染。 　　2.3接种室与接种器械 　　植物组织培养包括无菌操作和无菌培养技术，做好无菌操作室的消毒是至关重要的。污染的主要来源是空气中的细菌和真菌孢子。接种室内不干净，接种工具—镊子、剪刀以及培养瓶等落有灰尘，都可引起真菌生长。一般定期开窗换气，以免造成细菌周期性大面积发生。 　　2.4培养条件 　　在培养室内的培养条件中，温度和湿度与污染率密切相关。组培苗在高温、高湿环境下有利于杂菌滋长，所以污染率就高；温度冷、凉培养时，污染率就相对低一些。当发现污染的组培苗时，一定要及时清理。在植物病害中，真菌所引起的病害尤其严重，且因会产生孢子，随着空气飘散，一旦落入适当的环境下，一粒小小的孢子便会扩大成一个菌落，污染整个组织培养瓶。因此一旦有真菌污染的组培苗，就要用高压灭菌器彻底消灭，以防扩散。 　　3.防治措施 　　3.1培养基的灭菌 　　培养基封口后应尽快进行高温高压灭菌。灭菌不及时，会造成杂菌大量繁殖，使培养基失去效用。为了保证培养基灭菌彻底，降低污染，在灭菌过程中需注意以下几个环节： 　　①锅内灭菌物不能堆放过满，否则将阻碍蒸汽的流通和热交换，使容器内升温减慢，造成物体内部杀菌不完全。 　　②压力升到0.5kg/cm2时打开放汽阀，将锅内冷空气彻底排放干净，防止灭菌不彻底，然后再关闭放汽阀，使压力稳定。 　　③在压力1.1kg/cm2、温度为120～121℃下持续灭菌15～25min，灭菌时间不宜超过30min，以免引起培养基成分变化。 　　据报道，对于一些内生细菌可在培养基中加入一定浓度的抗菌素（青霉素Na 120mg/L +链霉素40mg/L），对其污染可起到一定程度的抑制作用[3]。 　　3.2基础苗的表面消毒 　　①在接种之前，基础苗需经严格的挑选，仔细观察待转基础苗，清除已被污染的基础苗，确认无污染才能取用。 　　②对于一些初期感染的基础苗，由于菌源太小，肉眼不易发现， 不确定是否被污染的基础苗也应果断清除。 　　③用75%酒精擦拭培养瓶的外壁（及瓶盖），消除附着在瓶外壁上的杂菌后放在超净工作台中，用紫外灯消毒20～30min备用。 　　3.3接种过程的注意事项 　　接种的基本技术环节是降低污染率的关键措施。在接种中，为了降低污染，应注意以下几项事宜： 　　①接种室保持干净整洁，应定期对接种室用75%酒精进行喷雾降尘和熏蒸（甲醛∶高锰酸钾=2∶1）灭菌[4]，并定期对接种室进行20～25min的紫外灭菌。在每次接种前，用紫外灯光照射、杀菌30～35min。 　　②接种过程中操作人员应及时用75%酒精擦拭双手和超净工作台台面及台壁。接种过程