虹彩病毒和柱状黄杆菌混合感染大鲵诊治.docVIP

虹彩病毒和柱状黄杆菌混合感染大鲵诊治 　　摘要：2012年7月，贵州省某大鲵养殖场发生了以大鲵体表和四肢多处溃烂、内脏器官出现充血、出血为特征的疾病，经过临床症状观察、病理剖检及实验室诊断，诊断为虹彩病毒（Iridovirus）和柱状黄杆菌（Flabobacterium columnare）的混合感染。通过采取综合有效的防治措施，大鲵疫情得到有效控制。 　　关键词：大鲵（Andrias davidianus）；虹彩病毒（Iridovirus）；柱状黄杆菌（Flabobacterium columnare）；混合感染 　　中图分类号：S947.3 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）13-3102-03 　　大鲵（Andrias davidianus），俗称娃娃鱼，是我国特有的珍稀有尾两栖动物，为国家二级保护动物，其经济价值高，具有广泛开发利用的前景。近年来，人工养殖大鲵中不断发生各种疾病，给养殖户造成惨重的经济损失。2012年7月，贵州省某大鲵养殖场发生了以大鲵体表和四肢多处溃烂、内脏器官出现充血、出血为特征的疾病，经过临床症状观察、病理剖检及实验室诊断，诊断为虹彩病毒（Iridovirus）和柱状黄杆菌（Flabobacterium columnare）的混合感染。通过采取有效的防治措施，大鲵疫情得到有效控制，现将诊治情况报告如下。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 试验动物 贵州省某大鲵养殖场发病大鲵，体重150～300 g，体长30.0～35.0 cm。 　　1.1.2 试剂 生化鉴定管和药敏纸片购自杭州微生物试剂有限公司；Goldview、Tris、EDTA、DNA Marker、Taq DNA聚合酶及dNTPs等购自宝生物（大连）工程有限公司；TIANamp病毒基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；引物由宝生物（大连）工程有限公司合成。 　　1.2 方法 　　1.2.1 临床症状观察及病理剖检 观察大鲵临床症状并对病死大鲵进行病理解剖，观察大鲵组织器官病变情况。 　　1.2.2 细菌生化鉴定与药敏试验 采用无菌操作剖取患病大鲵的肝脏组织，用接种环接种在普通琼脂平板上，28 ℃恒温培养18～24 h，观察是否有细菌生长。若分离出细菌，将进行细菌的生化鉴定与药敏特性的测定。药敏试验按常规药敏纸片法测定头孢噻吩、头孢拉定、庆大霉素、氟哌酸、头孢三嗪、强力霉素、头孢唑啉、卡那霉素、四环素、青霉素、氨苄???霉素、红霉素、洁霉素、多粘菌素B、痢特灵、复方新诺明、利福平、链霉素等抗菌素对分离菌株的抗药谱，测定抑菌圈直径。 　　1.2.3 16S rRNA基因序列分析 用TIANamp病毒基因组DNA提取试剂盒提取病死大鲵基因组DNA。采用细菌16S rRNA基因通用引物，16S rRNA-F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；16S rRNA-R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。采用25 μL反应体系：10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）2.0 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.5 μL，上下游引物各1.0 μL，DNA模板0.5 μL，补ddH2O至25 μL。PCR反应条件为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物经纯化后，送至宝生物（大连）工程有限公司进行序列测定。 　　1.2.4 患病大鲵虹彩病毒的PCR检测 参照文献[1]设计合成1对特异性扩增虹彩病毒主要核衣壳蛋白（MCP）基因的引物，PCR扩增检测虹彩病毒MCP基因，预期扩增片段大小为510 bp。MCP-F：5′-GACTTGGCCACTTATGAC-3′，MCP-R：5′-GTCTC 　　TGGAGAAGAAGAA-3′。 　　2 结果与分析 　　2.1 临床症状及病理剖检结果 　　大鲵因更换饵料而突然发病。发病初期大鲵行动缓慢，摄食量减少，5～7 d后出现腹部肿胀，前、后肢严重肿胀、溃烂，口腔黏膜弥漫性出血。用青霉素和庆大霉素浸泡，部分进行肌肉注射治疗无效，并在治疗过程中陆续死亡，发病大鲵死亡率高达90%。对病死大鲵进行病理剖检，下颌与腹部肌肉组织出现充血，腹腔内有大量淡黄色的积水，肝脏肿大，有淤血呈花斑状，胆囊充盈，脾脏、肾脏肿大，肠道充血出血，肠壁内充满了淡黄色的浆液（图1）。 　　2.2 细菌的分离培养 　　采用无菌操作取患病大鲵的肝脏组织，用接种环接种在普通琼脂平板上，28 ℃恒温培养18～24 h后长出1.0～2.5 mm大小的菌落，其表面光滑、湿润、有光泽