有机磷农药氧化乐果对小鼠睾丸细胞DNA损伤的研究.pptVIP

有机磷农药氧乐果对小鼠 睾丸细胞DNA损伤的研究 张 波 （北京联合大学应用文理学院生物学系，北京，100083） 有机磷农药是目前国内外使用较广的一类农药。具有品种多、药效高、用途广等特点。在防止农作物虫害、确保农作物高产、稳产、提高农畜产品的产量和质量方面起着重要的作用。是继有机氯农药后广泛使用于蔬菜、水果、谷类及茶叶等作物的占有重要地位的有机合成农药。 本文应用动物实验，研究了氧化乐果对小鼠睾丸细胞DNA的影响。 摘 要 本文运用单细胞凝胶电泳技术（又称彗星试验）研究了有机磷农药氧乐果对小鼠睾丸细胞DNA的损伤。研究结果表明，氧乐果可引起小鼠睾丸细胞彗星尾长显著大于对照组，且随氧乐果染毒剂量的增加，睾丸细胞彗星尾长度也增加，具有剂量效应关系。 1 材料及方法 ? 1.1 实验动物及染毒 昆明小鼠，鼠龄4周，体重30～35g，由北京大学医学部动物中心提供。随机分为染毒组和对照组，每组6只。低、中、高剂量染毒组分别灌胃1、2、4mg/kg氧乐果，处死前24小时禁食。 1.2 试剂及设备 40%氧乐果，河北新兴化工责任有限公司生产；正常熔点琼脂糖、低熔点琼脂糖、乙二胺四乙酸二钠、十二烷基肌氨酸钠、Triton-X100、溴化乙锭均为美国Sigma公司产品。Nikon 荧光显微镜。 1.3 实验方法 本文主要根据Singh等的方法[1]，略加修改。主要步骤如下。 单细胞悬液的制备： 灌胃6d后禁食24h，称体重，颈椎脱臼处死。立即取出睾丸，称重后在冰冷的生理盐水中洗净，剥离被膜，制得单细胞悬液。 胶板的制备： 将预热45℃的80μl 0.6%正常熔点琼脂糖 (NMA) 滴到预热的载玻片的磨砂面，迅速盖上干净的盖玻片，室温下10min使其凝固；将含细胞的70μl LMA滴到第一层胶板上，立即盖上干净的盖玻片，室温放置10min使其凝固；最后在凝固的LMA层滴加预热37℃的0.6%的LMA，盖上盖玻片，使其凝固。 细胞裂解： 移去盖玻片，将载玻片浸入新配置的细胞裂解液（2.5mol/l NaCl, 100mmol/l Na2EDTA, 10mmol/L Tris, 1%肌氨酸钠，pH 10，用前加入1%体积的Tritonx-100，10%的二甲基亚砜）中至少1h。 碱解旋： 裂解1小时后，取出载玻片，用PBS冲洗两次，然后将载玻片置于水平电泳槽中，倒入新配置的碱性电泳缓冲液（1mmol/l Na2EDTA, 300mmol/NaoH, pH13），约覆过胶面0.25cm左右，碱解旋20min，以便使DNA在碱性条件下解螺旋成单链DNA，使DNA断片在电泳场中易于迁移。 电泳： 以0.7V/cm电压电泳30min。 中和与染色： 电泳完毕后，将载玻片取出，吸水纸吸干电泳缓冲液，用0.4mol/l的Tris-HCl (pH7.5)中和15min，然后每片载玻片上滴加50μl 30ug/ml的溴化乙锭（EB）水溶液，盖上盖玻片，染色20min，即可观察。本试验采用Nikon 荧光显微镜进行拍照、分析。DNA图形呈桔红色，每张载玻片随机拍摄50个细胞，统计拖尾率，测量并计算细胞头长和尾长等指标，用MIM软件对所拍摄的图象进行分析，以此评估细胞DNA受损伤程度。 1.4 统计学处理 用SPSS10.0统计软件分析试验结果，t检验比较染毒组与对照组之间差异的显著性。 ? 2. 结果 ? 2.1 不同浓度氧乐果对小鼠睾丸细胞彗星拖尾率的影响 不同浓度氧乐果对小鼠睾丸细胞彗星拖尾率的影响见表1，小鼠染毒氧乐果以后，睾丸细胞彗星拖尾率显著增加（p0.01），且有明显剂量-效应关系。睾丸细胞核DNA迁移长度显著增加（p0.01），且DNA迁移长度随氧乐果浓度增加而增加（p0.01），有明显剂量-效应关系。 表1 不同剂量的氧乐果对小鼠睾丸细胞彗星尾长（μm）及拖尾率的影响 染毒剂量 动物数 细胞数 迁移细胞率 彗星尾长 （mg/kg（只） （个） （%） （μm） 0 6 300 12.03 6.30±3.3.6 1 6 300 75.76 12.62±4.72** 2 6 300