实验三 感受态菌的制备.pptVIP

感受态菌的制备 基础植物生物技术 提纲 一、目的 掌握一种感受态细胞的制作方法 三、材料 (一) 仪器 超净工作台；隔水式电热恒温培养箱；摇床；2102型分光光度计；Eppendorf 5417C 常温高速离心机；低温冰箱(-20℃)～-70℃)； 三、材料 (二) 器皿 刻度摇菌管，微量移液器，标记笔, EP管 (三)菌种 大肠杆菌DH-5α (四)培养基 LB液体培养基： 蛋白胨10克﹑酵母提取物5克和氯化钠10克用蒸馏水溶解至1000毫升，用10 mM NaOH调至pH 7.2-7.4, 湿热灭菌20分钟。 (五)试剂 1．0.1M CaCl2溶液： 称取无水氯化钙11.1 克，加ddH20至1000毫升，分装于100毫升三角烧瓶中，每瓶100毫升， 每组l瓶，于三洋MLS-3020型灭菌器 灭菌18分钟. * 基础植物生物技术 * 目的 1 原理 2 材料 3 方法 4 注意事项 5 二、原理 转化效率的高低与受体菌的感受态有关，所谓感受态，就是细菌吸收转化因子(周围围环境中的DNA分子)的生理状态。关于感受态的本质与存在，说法很多：目前主要有两种假说：1．局部原生质体化假说一一细菌表面的细胞壁结构发生变化，即局部失去钿胞壁或局部溶解细胞壁，使DNA分子能通过质膜进入细胞。2．酶受体假设一感受态细胞的表面形成一种能接受DNA的酶位点，使DNA分子能进入细胞。 二、原理 在细菌中，能发展感受态的细胞是占极少数，而只有发展 感受态的细胞才能稳定地摄取外来的DNA分子。而且细菌 的感受态是在短暂时间内发生的，保持感受态的时间约 1-2天，一般出现在生长对数期的后期。 三、材料 四、方法 1．取一环新鲜的大肠杆菌DH5斜面菌落于2毫升LB试管中， 在37℃振荡培养过夜(约200rpm／h). 平板活化 震荡培养 接种于LB培养基 四、方法 2．取1毫升上述菌液转接到100毫升LB三角烧瓶中(接种量 按菌液浓度而定，一般在1％左右)，振荡培养2-2.5小时(OD550=0.4-0.5)。 15毫升摇菌管 分光光度计 15毫升摇菌管 四、方法 3．菌液冰浴10分钟，4000 rpm／min 4℃离心10分钟, 收集菌体。 4．把菌体悬浮在10毫升0.1M CaCl2溶液，冰浴30分钟， 4000 rpm／min 4℃离心10分钟, 收集菌体。 加10 ml 预冷CaCl2 四、方法 5．再把菌体悬浮在2毫升的储存液中（1.65毫升0.1M冰 上预冷CaCl2，0.35毫升0.1M冰上预冷CaCl2),每管 50微升，于-70℃条件下储存 加2 ml 预冷储存液 * 基础植物生物技术