基因工程－11章 目的基因的表达.pptVIP

* * ScFv基因在pHOG21-2E3中表达产物的SDS－PAGE分析结果 1.标准蛋白质 markers，2和3 分别是XL1-Blue(pHOG-2E3) 和XL1-Blue(pHOG21) 胞周质可溶成分， ScFv 本章重点掌握的内容 概念:表达载体、融合基因、融合蛋白、开放阅读框架。 原核生物细胞表达的特点是什么？ 目的基因在原核细胞中表达具备哪些条件？ 载体pET-28a的主要构成元件及其功能。 制约目的基因表达的因素有哪些？ 试述提高目的基因在原核细胞中表达效率途径有哪些？ 举例说明提高蛋白表达稳定性途径有哪些？ 大肠杆菌基因表达载体的组成基因元件及常见的大肠杆菌表达系统有哪些？ T7表达载体的工作原理。 以基因融合和分泌形式表达外源蛋白的优点有哪些？ * * 思 考 题 如何以大肠杆菌质粒DNA为载体克隆一个编码干扰素的基因，并使之在大肠杆菌中进行表达？简要说明实验中可能遇到的问题及可能解决办法。 * * 作 业 题 1.写课程总结,把前9章内容归纳整理后，写在一张 A4纸的正反面上。 2.按照《生物工程学报》格式，撰写关于“无细胞翻译系统”方面研究进展综述,要求：字数2千左右,中英文摘要,中外文参考文献各5篇以上。 * * * * Alpha-toxin Alpha-toxin 6、优化发酵过程◆工艺方面的因素:如选择合适的发酵系统或生物反应器，目前应用较多的有罐式搅拌反应器、鼓泡反应器和气升式反应器等。 * * ◆生物学方面的因素: 一是与细菌生长密切相关条件或因素，如发酵中的溶氧、pH值、温度和培养基成分等。 二是对外源基因表达条件的优化。在发酵罐内工程菌生长到一定阶段后，开始诱导外源基因的表达，诱导的方式包括添加特异性诱导物和改变培养温度等。 三是提高外源基因表达产物的总量。外源基因表达产物总量取决于外源基因表达水平和菌体浓度。 * * 三、大肠杆菌表达系统 表达载体(expression vector) 在克隆载体基础上，为使插入的外源DNA片段有效转录翻译成多肽，装有强化外源基因表达的强启动子以及利于表达产物分泌、分离和纯化的元件，这种载体称为表达载体。 * * 1、大肠杆菌基因表达载体的结构 大肠杆菌基因表达载体的构建时包括的基因元件：复制子、启动子、终止子、核糖体结合位点、翻译的起始密码子和终止密码子、选择标记等。 常见大肠杆菌基因表达系统：Lac和Tac表达系统、PL和PR表达系统、T7表达系统等。 * * 2、宿主菌 大肠杆菌基因表达系统的基因一般都是异源基因，在大肠杆菌中不稳定的原因包括： ◆大肠杆菌缺乏复杂翻译后加工和蛋白质折叠系统。 ◆大肠杆菌不具备类似真核细胞的亚细胞结构和表达产物的稳定因子。 ◆大量的异源重组蛋白在大肠杆菌细胞中形成高浓度微环境，导致蛋白质分子之间的作用增强。 为了使外源基因高效表达，必须构建作为基因表达受体菌的大肠杆菌工程菌株。 * * * * 3、T7 表达载体 * * T7 表达载体的工作原理 T7噬菌体启动子只能由T7噬菌体的RNA聚合酶识别并启动转录，因此宿主细胞必须能表达T7噬菌体的RNA聚合酶。 大肠杆菌BL21(DE3)菌株染色体BL21区整合一个λ噬菌体DNA，在λ噬菌体的DE3区有一个T7 RNA聚合酶基因(T7基因1)，该基因受lacUV5启动子控制。 * * * * 当pET载体进入BL21(DE3)细胞后，由于宿主细胞的lacI基因表达产生阻抑物，从而抑制T7 RNA聚合酶基因的表达，在载体上的目的基因也无法启动。 当存在IPTG诱导物后，使阻抑物失去抑制作用， T7 RNA聚合酶基因得以表达，产生T7 RNA聚合酶，从而启动T7启动子控制的外源基因的表达。 * * * * 在没有诱导物存在的情况下，lac启动子控制的外源基因仍会有渗漏表达。如果外源基因对宿主细胞有害作用，就可能导致表达系统崩溃。 现有2套系统可控制外源基因的严紧表达： 一套是通过宿主控制T7 RNA聚合酶的量来实现，即在宿主细胞中引入一个带有T7噬菌体的溶菌酶编码基因的质粒，如plysS或plysE，它们分别低量和高量表达T7噬菌体的溶菌酶。该溶菌酶可抑制T7 RNA聚合酶的活性，从而减少在未诱导情况下外源基因的表达。 * * * * 另一套是使启动子的控制效应更严紧。在pET载体上装载lacI基因，提高阻制物的浓度，同时也可利用T7-lac启动子(在T7启动子序列下游装入一个由25bp组成的lacO操纵子序列)，当阻制物结合在lacO位点时，即使存在T7 RNA聚合酶，外源基因