环境和遗传因素导致男性不育与生缺陷的分子机制.docVIP

一、研究内容 拟解决的关键科学问题精子异常是男性不育和出生缺陷发生的主要原因。阐明EDCs、遗传因子改变致精子异常的分子机制和机体对EDCs易感性差异是本项研究的关键科学问题。其中包括： 代表性EDCs通过何种分子机制影响下丘脑-垂体-睾丸轴以及精子发生、成熟过程的不同环节，从而引起的各类表型？2. 遗传因子如染色体重组交换和联会改变引起精子发生停滞或染色体异常的分子机制和调控机理是什么？ 3. 环境-交互作用导致男性不育作用模式和机制是什么？4. 精子异常导致常见出生缺陷如染色体病和先天性心脏病发生的机制是什么主要研究内容1．环境因素导致精子异常的分子机制 1.1代表性EDCs的代谢特征及其与精子异常的关系 通过体内和体外研究代表性EDCs的代谢特征，阐明EDCs内暴露与精子异常的关联，寻找接触性生物标志物。拟选择邻苯二甲酸酯类、烷基酚类/双酚系化合物、农药杀虫剂类、多环芳烃类、多溴联苯醚、全氟代烃类和重金属类为目标EDCs。动物染毒模型，初步筛选出关键的EDCs因子；然后围绕这些关键EDCs，收集男性不育（精子异常）职业暴露人群和正常男性对照例，采集流行病学信息和精液、血液、尿液生物样本，男性不育（精子异常） 运用动物染毒模型结合基因芯片技术筛选与EDCs有关的代谢酶基因用酶反应学、细胞生物学和分析技术，鉴定代表性EDCs的关键代谢酶、代谢特征，初步确定候选代谢产物。利用受体报告基因系统，甄别候选代谢产物的雌激素/抗雌激素、雄激素/抗雄激素、甲状腺激素/抗甲状腺激素活性，初步明确代表性EDCs代谢产物的内分泌干扰活性运用动物模型研究代表性EDCs候选代谢产物与精子异常的关系，初步确认相关EDCs特征性代谢产物；应用等方法分析病例和对照人群生物样本中EDCs的代谢产物水平与男性精子异常的相关性，代表性EDCs的接触性生物标志物。运用代谢组学的研究思路，应用PLC-Q-TOF等方法针对精子异常不同表型和对照的生物样本进行代谢分析，结合等数据分析平台进行，进一步验证上述生物标志物。1.2 代表性EDCs致精子发生异常的分子靶标 通过系统代表性EDCs对下丘脑-垂体-睾丸轴以及精子发生、成熟过程不同环节的影响，初步阐明代表性EDCs对雄性生殖损害的靶点和分子途径。 不同发育阶段下丘脑-垂体-睾丸轴定点染毒的方法，观察染毒位点下游靶细胞的变化，分析相应激素的分泌和相关基因的表达，确定EDCs损伤下丘脑-垂体-睾丸轴的作用位点。重点关注代表性EDCs通过下丘脑-垂体-睾丸轴影响精子发生的微环境激素调控作用及方式，特别是支持细胞、间质细胞对精子细胞的影响及它们的相互作用。运用基因组学、miRNA基因芯片技术构建正常小鼠和染毒小鼠精子发生不同阶段睾丸基因、蛋白质和miRNA表达谱，通过比对获得差异表达基因、蛋白质和miRNA，作为EDCs导致精子发生障碍的侯选作用靶分子，对部分差异基因、蛋白质和miRNA进行功能研究，阐明EDCs的作用机制。同时，采用生物信息学技术对所获得差异表达基因及其编码蛋白进行整合分析，发现EDCs导致精子发生障碍的新的作用通路，试图找到关键性的分子标记物。，运用RNA干扰基因敲除技术，建立标志性分子缺陷动物模型，验证上述标志性分子对的。 2．遗传因素导致精子异常的调控 2.1 减数分裂重组交换异常精子发生异常的分子机制 MLH1是重组交换过程中蛋白，MLH1在精子的确切重组交换异常导致不育和非整倍体形成的分子机理。 分别获取人类正常、、有染色体分离错误的严重寡精患者的睾丸活检组织，运用免疫荧光细胞遗传学等方法对MLH1的数目、位置及调控如位点干涉、重组交换相关的重要事件(如同源染色体配对、联会)和减数分裂停滞、染色体分离错误之间的关系进行关联度的研究。MLH1分布的因素如年龄、甲基化miRNA、染色体端粒长度和端粒酶活性。运用免疫荧光细胞遗传学研究已知的重组交换相关蛋白(如RAD51/DMC1等)的时空表达模式和与MLH1共定位情况。运用酵母双杂交或免疫共沉淀筛选出与MLH1结合的未知蛋白。然后综合运用活细胞实时摄影、技术、免疫共沉淀或酵母双杂交等研究MLH1与这些已知/未知的重组交换蛋白之间的相互作用，确定这些蛋白相互作用的改变对精子生成的影响及其分子机制。在此基础上找出关键的染色体重组交换相关的蛋白运用基因敲除、RNA干扰或转基因小鼠动物模型来这些基因的功能和对精子发生的影响及作用的分子机制。运用基因芯片分析具有染色体分离错误的睾丸基因表达方案，与正常睾丸基因表达方案比较，找出差异表达显著的基因，结合生物信息学方法对差异表达显著的基因进行染色体定位，然后对这些基因再用实时定量RT-PCR来确认运用基因敲除、RNA干扰或转基因小鼠动物模型来这些基因的功能并根据这些基因的功能进一步分析重组交换异常导致染色体分离