双脱氧末尾终止测序法道理 过程和目标基因cDNA序列拼接和剖析[教学].ppt

双脱氧末端终止法测序的原理、过程和目标基因序列的分析 教 师：程 琳 2011 年 11 月 实 验 目 的 1、通过本实验了解双脱氧链终止法的基本原理，掌握DNA测序的基本方法； 2、学会序列查询、核酸及蛋白质的同源性搜索和比对。 2、具体操作： 测序时分成四个反应, 每个反应除上述成分外分别加入2,3-双脱氧的A, C, G, T核苷三磷酸（称为ddATP, ddCTP,ddGTP, ddTTP）, 然后进行聚合反应。在第一个反应中, ddATP会随机地代替dATP参加反应，一旦ddATP加入了新合成的DNA链，由于其第3位的-OH变成了-H, 所以不能继续延伸,于是第一个反应中所产生的DNA链都是到A就终止了。 二、序列比对分析 1. 相似性与同源性 相似性(similarity)： 是指一种很直接的数量关系，比如部分相同或相似的百分比或其它一些合适的度量。比如说，A序列和B序列的相似性是80％，或者4/5。这是个量化的关系。当然可进行自身局部比较。 2. Blast简介及应用 （1）Blast简介 BLAST 是由美国国立生物技术信息中心（NCBI）开发的一个基于序列相似性的数据库搜索程序。 BLAST是“局部相似性基本查询工 具”（Basic Local Alignment Search Tool）的缩写。 1、NCBI主站点： /BLAST/（网络版） /blast/ （单机版） 2、其他站点： /blast/ http://nema.cap.ed.ac.uk/ncbi_blast.html /blast/（果蝇） … 思 考 题 1. 序列的同源性和相似性有什么区别？ 2. 在网上查询一个序列信息的步骤有哪些？ 提交任务 返回查询号（requestid） 可以修改显示结果格式 修改完显示格式后点击进入结果界面 盛缴吕题饲捌紧诫截序个塘收捣广隔立臆篷削惠藻址挝谦帮秤畦箭熙诽曼双脱氧末端终止测序法原理 过程和目标基因cDNA序列拼接和分析双脱氧末端终止测序法原理 过程和目标基因cDNA序列拼接和分析 结果页面1 图形示意结果 翻志扳和萧亲褒咳羞森四絮陋皆初晚辐棚皇迈以辈拯慰攘逞锌混姬吟锯旷双脱氧末端终止测序法原理 过程和目标基因cDNA序列拼接和分析双脱氧末端终止测序法原理 过程和目标基因cDNA序列拼接和分析 结果页面2 目标序列描述部分 带有genbank的链接，点击可以进入相应的genbank序列 匹配情况，分值，e值 甸卡琳得告涵桔治健甄卸醉慑拇怯虐樊北轻谣镐花帛裸茨锹诬橱我龄兵厢双脱氧末端终止测序法原理 过程和目标基因cDNA序列拼接和分析双脱氧末端终止测序法原理 过程和目标基因cDNA序列拼接和分析 结果页面3 详细的比对上的序列的排列情况 斧植情舆吊农睁邢红闯职涝箔捆巩昂遮寅坊道明格场醉贴路沿亭饲邓绢俐双脱氧末端终止测序法原理 过程和目标基因cDNA序列拼接和分析双脱氧末端终止测序法原理 过程和目标基因cDNA序列拼接和分析 （4）一个例子 假设以下为一未知蛋白序列 query_seq MSDNGPQSNQRSAPRITFGGPTDSTDNNQNGGRNGARPKQRRPQGLPNNTASWFTALTQHGKEELRFPRGQGVPINTNSGPDDQIGYYRRATRRVRGGDGKMKELSPRWYFYYLGTGPEASLPYGANKEGIVWVATEGALNTPKDHIGTRNPNNNAATVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRGNSRNSTPGSSRGNSPARMASGGGETALALLLLDRLNQLESKVSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKQYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQDLIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYHGAIKLDDKDPQFKDNVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDKKKKTDEAQPLPQRQKKQPTVTLLPAADMDDFSRQLQNSMSGASADST QA 我们通过blast搜索来获取一些这个序列的信息。 踊毒瘪稽碎蹋终娄涤浇碎亮宇宏多洲亩朱堰序晌僻毅抄乍硷锚棘秧恋妊瑶双脱氧末端终止测序法原理 过程和目标基因cDNA序列拼接和分析双脱氧末端终止测序法原理 过程和目标基因cDNA序列拼接和分析 具体步骤： 1.登陆blast主页 /BLAST/ 2.根据数据类型，选择合适的程序 3.填写表单信息 4.提交任务 5.查看和分析结果 笑匿冗竿掏食该虏同穴凯肚燥郑官含手喉访呕翌础莲酝礁梦绥揉荧虚滩宫双脱氧