咖啡酸在大鼠体内绝对生物利用度及其在肠道吸收特性研究.docVIP

咖啡酸在大鼠体内绝对生物利用度及其在肠道吸收特性研究 　　[摘要] 目的：研究咖啡酸在大鼠体内的绝对生物利用度及其在肠道的吸收特性。方法：大鼠分别采用静脉（2 mg?kg-1）、灌胃（10 mg?kg-1）给药研究咖啡的绝对生物利用度；建立大鼠原位肠血管灌流模型研究咖啡酸在肠道的吸收率；采用Caco-2细胞模型研究咖啡酸的双向转运情况。结果：咖啡酸静脉（2 mg?kg-1）、灌胃（10 mg?kg-1）给药后，在大鼠体内的药动学行为均符合二室模型，咖啡酸的绝对生物利用度为14.7%；咖啡酸在肠血管灌流模型中的吸收率为12.4%；咖啡酸的PappAP→BL及PappBL→AP不随浓度的变化而变化，且在实验浓度的范围内，PappBL→AP/PappAP→BL均大于2。结论：咖啡酸绝对生物利用度低，肠道吸收率少，在Caco-2细胞单层模型中的转运途径可能为主动转运。 　　[关键词]咖啡酸；生物利用度；肠吸收率；通透性 　　咖啡酸（3， 4-二羟基肉桂酸）是自然界中分布非常广泛的多酚类化合物，具有抗氧化、抗菌、抗癌等作用[1-3]。有研究报道，每天摄食一定量的咖啡酸可以预防肝癌、皮肤癌[4-5]。咖啡酸是咖啡酸片主要成分，临床上用于止血。据报道咖啡酸的代谢部位主要是小肠，经肠道细菌代谢[6]。咖啡酸在大鼠血浆中代谢物主要是葡醛酸结合物、硫酸结合物及少量的原型药物[7]。少有文献报道咖啡酸的绝对生物利用度，因此，本文采用传统的体内法研究咖啡酸在大鼠体内的绝对生物利用，建立大鼠原位肠血管灌流法研究咖啡酸的肠吸收率及运用Caco-2细胞模型研究咖啡的通透性，旨为咖啡的临床应用提供理论指导。 　　1材料 　　咖啡酸（110885-200102）、肉桂酸（110786-200503）购自中国食品药品检定研究院；牛血清白蛋白购自齐云生物技术有限公司；DMEM 培养基、胎牛血清、非必需氨基酸购自美国Hyclone 公司；L-谷氨酰胺、胰蛋白酶，购自美国Sigma 公司。乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。 　　血管灌流Krebs-Ringer′s 液的配制：称取NaCl 7.8 g，KCl 0.35 g，CaCl2 0.37 g，MgCl2 0.22 g，NaH2PO4 0.32 g，葡萄糖 3.0 g，NaHCO3 1.37 g，蒸馏水定容至1 L，临用前加入5%牛血清白蛋白。HBSS溶液的配制：称取8 g NaCl，0.4 g KCl，1 g 葡萄糖，60 mg KH2PO4，47.5 mg Na2HPO4，调pH至7.2，加蒸馏水定容至1 L。 　　4000Q TRAP 串联四极杆质谱仪（美国Applied Biosystem 公司）；LC-20AD 高效液相色谱仪（日本岛津公司）；细胞培养箱（德国Hearous 公司）；24 孔Transwell培养板（美国Costar 公司）；Millicell-ERS跨膜电阻仪（美国Millipore 公司）；飞鸽高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；HL-2D 恒流泵（上海精科实业有限公司）。 　　SD 大鼠，雄性，体质量200～250 g，购自广州中医药大学实验动物中心，许可证号SCXK（粤）2008-0020。 　　2方法 　　2.1分析方法 　　2.1.1色谱条件 色谱柱为Phenomenex C18柱（2.0 mm×50 mm，5 μm），柱温30 ℃；流动相A 为甲醇-水（5∶95）和10 mmol?L-1醋酸铵，流动相B为甲醇-水（95∶5）和10 mmol?L-1醋酸铵；梯度洗脱程序如下：0～0.5 min，0%B；0.5～0.8 min，0～100%B；0.8～3.0 min，100%B；3.0～3.2 min，100%～0 B；3.2～5.0 min，0%B；流速0.2 mL?min-1；进样量10 μL。 　　2.1.2质谱条件 ESI离子源；MRM检测模式；检测离子为负离子[M-H]-；离子源温度550 ℃；离子喷雾电压-4 500 V；Gas 1为0.379 MPa；Gas 2为0.379 MPa；气帘气压0.138 MPa；咖啡酸和内标肉桂酸的检测离子对分别为m/z：178.9/134.8，146.8/102.8。 　　2.2咖啡酸体内药动学考察 　　12只SD大鼠随机平均分成2组，分别为静脉注射组和灌胃组。静脉注射组大鼠按2 mg?kg-1于股静脉注射给药，并与给药后0.083，0.167，0.5，1，2，3，5，8，12 h 眼球后静脉丛采血0.5 mL。灌胃组大鼠按10 mg?kg-1的剂量灌胃给予咖啡酸，于给药后0.083，0.167，0.333，0.5，1，2，3，4，6，12 h 眼球后静脉丛采血0.5 mL。分离血浆，甲醇溶液沉淀蛋白后低