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慢性脑低灌注大鼠海马组织中IDO变化 　　摘要：目的观察慢性脑低灌注大鼠海马组织中干扰素（IFNγ）、吲哚胺2，3双加氧酶（IDO）的表达，探讨IDO在慢性脑低灌注导致认知功能损害中的作用。方法用双侧颈总动脉永久性结扎（2VO）制作慢性脑低灌注大鼠模型，Morris水迷宫检测2VO大鼠空间学习与记忆能力变化，免疫组化检测大鼠海马CA1区IFNγ的表达，ELISA法检测IDO的表达。结果慢性脑低灌注大鼠的空间记忆能力较假手术组显著下降，海马IFNγ、IDO表达较假手术组增加（P 　　关键词：慢性低灌注；吲哚胺2，3双加氧酶；海马组织 　　中图分类号：R363文献标识码：A文章编号2012 　　慢性脑低灌注（chroniccerebralhypoperfusion）是神经系统一种常见的病理状态，多项基础与临床研究都显示无论是阿尔兹海默病（AD）还是血管性痴呆（VaD）都存在不同程度的慢性脑低灌注。目前对慢性脑低灌注导致认知与神经功能障碍的机制尚不完全清楚。近年来有报道，炎性免疫反应在痴呆等慢性缺血性脑血管病方面有重要作用。近年发现，在干扰素（IFNγ）作用下，中枢神经系统星形神经胶质细胞、小胶质细胞都能表达吲哚胺2，3双加氧酶（indoleamine2，3dioxygenase，IDO），在中枢神经系统疾病中起着重要作用[1]。 　　本实验采用永久性双侧颈总动脉结扎术模型（2VO）模拟慢性低灌注状态，用Morris水迷宫检测2VO大鼠空间学习与记忆能力变化，通过观察大鼠海马IFNγ、IDO的表达，探讨IDO在慢性脑低灌注导致认知功能损害炎性发病机制中的作用。 　　1材料与方法 　　1.1动物成年健康雄性Wistar大鼠36只，体质量（203.8±7.8）g，由山西医科大学动物中心提供，在具有通风设备的动物房内笼养，在实验前后过程中均给予充足的水及食物。随机分成假手术组与模型组，各18只。 　　1.2动物模型的制备参照Wakita等[2]的方法进行2VO模型制备。大鼠于术前12h禁食，4h禁水。10%水合氯醛（350mg/kg体重）腹腔注射麻醉。将大鼠仰卧固定，行腹侧颈正中切口，钝性分离双侧颈总动脉，用4号手术线行双重结扎。术后缝合切口并连续3d肌肉注射2×105U青霉素钠，放回笼中保温（26℃）饲养。对照组处理步骤同上，但不进行颈总动脉结扎。在整???实验过程中。模型组大鼠死亡3只，假手术组大鼠全部存活。 　　1.3Morris水迷宫行为学测试动物模型制备4周后行水迷宫测试，实验参照Vorhees等[3]总结的方法进行，主要包括定位航行实验和空间探索实验2个部分。定位航行实验：连续训练5d，每天上午、下午2个时段，每个时段训练3次，分别从3个象限入水。发现平台后，让其在平台上站立30s，将大鼠从平台上拿下来休息60s，再随机由下一象限入水进行试验，如果120s内找不到平台，则由操作者帮助其上平台，潜伏期记为最高分120s。记录大鼠找到平台的时间（逃避潜伏期）。每天计算其平均数。空间探索实验：用于测量大鼠学会寻找平台后对平台空间位置记忆的保持能力，定位航行实验后，即在第6天上午，撤除水下平台，取任意1个入水点将大鼠面向池壁放入水中，测定其120s内在平台象限的游泳距离占总距离的百分比（distancepercentage，DP）。 　　1.4取海马各组大鼠行为观察结束后，将大鼠麻醉后断头处死，迅速剥离脑组织，沿视交叉前端作冠状切面，立即在冰盒上无菌分离出海马组织，置-70℃冰箱/10%多聚甲醛中备用。 　　1.5IDO的检测海马组织和生理盐水1∶9比例冰上匀浆，将海马研磨成匀浆，3500r/min离心10min，取上清液。试验中采用IDO试剂盒检测，采用比色法在酶标板上反应。设标准管8管，第1管加蒸馏水950μL，第2～8管加入蒸馏水500μL，在第1管中加入100ng/mL的标准品溶液50μL，混匀后加样器吸出500μL，移至第2管，如此反复作对倍稀释，从第7管中吸出500μL弃出，第8管为空白对照。每孔加入标准品或待测样品20μL。每孔加入底物工作液100μL，置37℃暗处反应15min。每孔加入100μL终止液混匀。标准品和样品中的IDO与底物工作液显色30min内用酶标仪在450nm处测吸光值（OD）。IDO浓度与OD值成正比，通过绘制标准曲线求出标本中IDO浓度。 　　1）为山西省科技厅青年基金资助项目（No.20090210421）1.6免疫组织化学法观察INFγ的表达：大鼠海马组织经4℃的4%多聚甲醛72h充分固定后，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，制备厚4μm组织切片。切片经脱蜡至水化，3%H2O2灭活内源性酶，蒸馏水冲洗；枸橼酸盐缓冲液，微波热修复2