兔血清纯化.docxVIP

兔血清抗体分离纯化抗血清纯化的目的是尽量除去抗血清中与目的抗体不相关的成分，以防止抗体外的其他血清成分对试验结果产生影响。因此只能根据不同目的的要求，从抗血清中除去容易干扰的有关成分，或提取相应的免疫球蛋白。?抗血清纯化的方法主要有粗提法和精制法两个过程。粗提法主要常用硫酸铵盐析法，精制法分非特异性和特异性两种类型。非特异性方法如葡聚糖凝胶过滤法、离子交换层析法，其方法均系基于蛋白质分子的物理性质。特异性方法如免疫吸附法，其方法基于抗原抗体的特异性反应。一、盐析法(Salt fractionation)（粗提）【实验原理】当用中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对于水分子的亲和力大于蛋白质，于是蛋白质水分子周围的水化膜减弱甚至消失；同时，中性盐加入蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白质溶解度降低，使蛋白质分子间聚集而沉淀。不同蛋白质由于所带电荷不同以及水化程度不同，加入不同浓度的中性盐可分段从溶液中沉淀出来。蛋白质在不同浓度的盐溶液中相对溶解度不同，血清γ球蛋白在一定浓度盐溶液中易于沉淀，而白蛋白则不易沉淀，据此可将二者分离。盐析法：硫酸铵分级沉淀【主要试剂与仪器】实验材料：兔血清（20ml-200ml）试剂：饱和硫酸铵溶液（用前以5 mol/L NaOH调至pH7.4）、0.01 mol/L Ph7.4磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffered Saline PBS）、奈氏试剂实验器材：三角瓶、烧杯、各种吸管、小试管、量筒、布氏漏斗、透析袋（用前用PBS或双蒸水煮沸10min）等仪器：搅拌器、离心机、电泳仪等【溶液配制】a、饱和硫酸铵溶液的配制：取500 ml蒸馏水加热至70～80 ℃，称(NH4)2SO4 400～425g溶于蒸馏水中，搅拌20 min，趁热过滤，冷却，配制好的饱和硫酸铵溶液，瓶底应有结晶析出，在使用前用28%的氨水调pH至7.4。b、磷酸盐缓冲液的配制：贮存液 A液 0.2M NaH2PO4·2H2O 31.2g，加蒸馏水1000ml B液 0.2M Na2HPO4·12H2O 71.7g，加蒸馏水至1000ml应用液 取A液19ml加B液81ml混合，再以生理盐水作10倍稀释，加入NaCl至终浓度为0.85%，即为PBS。c、奈氏试剂的配制： 取HgI 11.5g，KI 8.0g，加双蒸水至50ml；搅拌溶解后过滤，滤液中再加入浓度为20%的溶液NaOH 50ml。【方法步骤】取制备好的血清20ml，加入20ml磷酸盐缓冲液混匀，然后逐滴加入(NH4)2SO4饱和溶液40ml，使成50%(NH4)2SO4溶液，边加边搅拌，防止形成团块减低沉淀物的特异性，充分混合，在4℃条件下静止3h以上，使其充分沉淀。低温高速10000r/min离心10min，弃去上清液。用6ml磷酸盐缓冲液溶解沉淀，再加(NH4)2SO4饱和溶液3ml，使成为33%(NH4)2SO4溶液，充分混合，4℃静止3h以上。低温高速10000r/min离心10min，弃去上清液。为进一步纯化，可重复步骤（3）2～3次。用6mlPBS溶解沉淀，装入透析袋。透析除盐，中间换液数次，至奈氏试剂测透析外液无黄色，放-20℃冰箱保存。【效果评估】（1）定量鉴定：取样品少许作适量稀释，以紫外分光光度计测量含量，260nm、280nm处读数OD值。蛋白含量（mg/mL）=（1.45×OD 280nm-0.74×OD 260nm）×样品稀释度注：式中1.45与0.74为常数，nm为波长。（2）抗体纯度鉴定：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）【注意事项】1、用于盐析的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁、氯化钠、磷酸盐等，最常用的是硫酸铵，因为硫酸铵饱和溶液所含盐浓度很高，溶解度受温度影响小，一般不引起蛋白质变性，但不纯的硫酸铵含重金属，会影响蛋白质生物活性，故应用分析纯试剂。2、温度盐析蛋白时温度要求并不严格，一般在室温(25℃)比在0℃时更易析出，除非盐析对温度敏感的蛋白质(如抗体)要求在4℃进行。3、透析除盐透析液内NH4+的检测可用纳氏试剂，如产生黄色沉淀证明NH4+的存在。4、经盐析法提取的蛋白质为粗提的免疫球蛋白，若要获得纯化的免疫球蛋白，必须经凝胶过滤或离子交换层析提纯。二、辛酸-硫酸铵沉淀法【实验原理】辛酸-硫酸铵法分两步进行。第一步用辛酸沉淀杂蛋白，辛酸为短链脂肪酸，在酸性条件下可沉淀血清中的白蛋白或者其他非lg蛋白质；第二步利用硫酸铵盐析将lg沉淀下来。【主要试剂与仪器】实验材料：兔血清（20ml-200ml）试剂：乙酸-乙酸钠缓冲液（Ph4.5）、辛酸、10×磷酸盐-NaCl缓冲液（PBS pH7.4）、硫酸铵实验器材：三角瓶、烧杯、各种吸管、小试管、量筒、滤纸、布氏漏斗、透析袋（用前