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北柴胡花药愈伤组织高效再生体系建立 　　[摘要] 以花粉发育处于单核期的北柴胡花药为外植体诱导出愈伤组织，愈伤组织经多次继代培养后，置于20种含不同植物激素的分化培养基上诱导分化。分别在培养21，49 d后，统计每种培养基中分化出苗数，同时观察再生植株生长状况，从中筛选出分化率高，分化速度快，且植株生长状态良好的分化培养基。结果共在19种培养基均可分化出苗，分化率在3%～60%，大部分低于20%。在MS+KT 0、5 mg?L-1+蔗糖30 g?L-1+植物凝胶5 g?L-1培养基上分化率最高，为60%，其次为MS+ ZT 1、0 mg?L-1+蔗糖30 g?L-1+植物凝胶5 g?L-1，为58%。另外，针对在分化培养基中未能生根的再生芽，进行了生根培养基筛选。结果显示再生芽在生根培养基MS+蔗糖30 g?L-1 +植物凝胶5 g?L-1和1/2 MS+ NAA 0、5 mg?L-1+蔗糖30 g?L-1 +植物凝胶5 g?L-1中均可生根，生根率均为100%。由此建立了北柴胡花药愈伤组织高效稳定的再生体系。 　　[关键词] 北柴胡；愈伤组织；再生体系 　　[稿件编号] 2013-04-03 　　[基金项目] 国家自然科学基金项目；北京市自然科学基金项目（5102033）；中医药行业科研专项（201107011） 　　[通信作者] * 隋春，副研究员，Tel： （010） E-mail：csui@implad、ac、cn 北柴胡Bupleurum chinense DC、为伞形科柴胡属植物，是《中国药典》（2010年版）规定的药用柴胡的基原之一，具有解表退热、疏肝解郁、升举阳气的功效。植物组织培养再生体系在植物尤其是珍稀濒危物种的快速繁殖等方面有广泛应用，也是植物转基因研究的基础。对于北柴胡的组织培养再生体系的研究已有报道，如姚智等[1]以无菌苗为外植体诱导出了北柴胡愈伤组织，并对北柴胡愈伤组织生长和不定根诱导的条件进行了探讨；郝建平等[2]对北柴胡叶片、茎段和花芽进行了愈伤组织诱导、分化及不定芽增殖条件的研究。本实验室杨成民等[3]也诱导出了北柴胡花药愈伤。花药离体培养是植物进行单倍体诱导的有效途径之一。目前，许多药用植物已利用花药培养获得单倍体，如丹参Salvia sclarea L、、毛地黄Digitalis purpurea Linn、、西洋参Panax quinquifolius L、、宁夏枸杞Lycium barbarum L、、人参Panax ginseng C、 A、 Mey、、平贝母Fritillaria ussuriensis Maxim、??[4-9]。在伞形科植物中，胡萝属胡萝卜Daucus carota L、、茴香属茴香Foeniculum vulgare Mill、、鸭儿芹属鸭儿芹Cryptotaenia japonica Hassk、、芹属旱芹Apium graveolens L、也已通过花药培养再生出单倍体苗[10-11]。而柴胡属中三岛柴胡B、 falcatum L、已通过花药培养获得单倍体，但胚性愈伤和植株再生率仍然较低[12-14]。 　　本研究首先参考以往报道，以花药愈伤诱导植株分化，分化出芽的极少，而分化出了大量根。以北柴胡处于单核期的花药为外植体诱导愈伤组织，设计含有不同种类、不同浓度外源植物激素的20种分化培养基，对北柴胡花药愈伤分化出苗的最佳条件进行了筛选，以建立其高效稳定的再生体系，柴胡高效稳定再生体系的建立，将为通过转基因研究北柴胡基因功能奠定重要基础，也将为柴胡种质扩繁等研究应用提供借鉴参考。 　　1 材料 　　植物材料为本实验室选育的北柴胡B、 chinense新品种“中柴2号”，取花粉发育处于单核期的花蕾为外植体。 　　2 方法 　　2、1 北柴胡愈伤组织的诱导 　　花药愈伤组织诱导：参考杨成民等报道[3]，将采摘的花蕾于7 ℃冰箱冷藏3 d，70%乙醇处理1 min，无菌水润洗1次，然后用6%次氯酸钠溶液处理20 min，无菌水润洗3遍。接种前用无菌滤纸吸干水分，剥出花药，去除花丝，接种于MS+2，4-D 1、2 mg?L-1 +谷氨酰胺0、4 g?L-1 +水解酪蛋白0、2 g?L-1 +麦芽糖30 g?L-1 +植物凝胶3、5 g?L-1的培养基中，25 ℃暗培养，诱导愈伤组织形成。 　　2、2 愈伤组织的增殖 　　将诱导出的花药愈伤组织置于继代培养基MS+2，4-D 1、0 mg?L-1+6-BA 0、1 mg?L-1+谷氨酰胺0、4 g?L-1+水解酪蛋白0、2 g?L-1+甘露醇3 g?L-1+麦芽糖30 g?L-1 +植物凝胶5 g?L-1中增殖，25 ℃暗培养，14～21 d继代1次。