山茱萸总苷干预急性缺氧乳鼠心肌细胞凋亡研究.docVIP

山茱萸总苷干预急性缺氧乳鼠心肌细胞凋亡研究 　　摘要：目的探讨山茱萸总苷对急性缺氧乳鼠心肌细胞凋亡的影响。方法原代培养乳鼠的心肌细胞，采用液状石蜡封闭法建立缺血缺氧模型，并将原代培养3d的心肌细胞分为对照组、缺氧组（1h、2h、3h、5h）及治疗组，药物浓度为生药10g/L，采用TUNEL法检测各组的凋亡率。结果与对照组相比，缺氧组各时间点凋亡率明显上升，差别有统计学意义（P 　　关键词：山茱萸总苷；急性缺氧；乳鼠；心肌细胞凋亡 　　中图分类号：R285.5文献标识码：A文章编号2012 　　急性心肌梗死时心肌细胞死亡的方式不仅表现为细胞坏死，还表现为细胞凋亡。心肌细胞凋亡也是心肌梗死后心肌重构和心力衰竭的重要病理因素。因此，防治心肌细胞凋亡是现在一种重要的治疗目标。本研究观察了山茱萸总苷对急性缺氧乳鼠心肌细胞凋亡的防治作用。 　　1材料与方法 　　1.1动物出生1d～3d的SD大鼠，由中山大学实验动物中心提供。 　　1.2试剂DMEM/F12培养基，吉诺生物医药技术有限公司产品；DMEM无糖培养基，Gibco公司产品；胎牛血清，Gbico公司产品；0.25%胰蛋白酶，吉诺生物医药技术有限公司产品；青霉素链霉素溶液，Gibco公司产品；抗αSarcomericactin，武汉博士德生物有限公司产品；TUNELQIA39细胞凋亡试剂盒，购自Merck公司；SABC试剂盒及DAB显示试剂盒，购自武汉博士德生物有限公司。 　　1.3药物山茱萸，广东一方制药有限公司提供。 　　1.4主要仪器CO2细胞培养箱，Thermo公司；荧光显微镜，Nikon公司。 　　1.5方法 　　1.5.1山茱萸总苷提取物制备由广东省中医研究所按文献[1]方法提取，提取物浓缩干燥至粉末状。 　　1.5.2心肌细胞原代培养将出生1d～3d的SD大鼠，用75%酒精消毒后取出心脏，迅速放入4℃预冷DHank’s液的培养皿中，洗去心脏表面及血管中的血细胞，剪去心房和大血管。将心脏剪成1mm×1mm×1mm大小的组织块，加入约10mL0.125%胰酶消化液，于37℃水浴箱中分次消化，每次约10min。收集除第1次以外的细胞悬液于50mL离心管中，加入含量为10%FBS的DMEM/F12培养液，终止消化。1000r/min离心5min，弃上清，加入含10%FBS的DMEM/F12培养液，轻轻吹打使其形成单细胞悬液，将细胞悬液吸入培养皿中，按差速贴壁法于37℃、5%CO2培养箱中孵育1.5h，去除成纤维细胞，纯化心肌细胞。之后轻轻收集尚未贴壁的细胞悬液，调整细胞密度为1×105/mL～5×105/mL，接种于6孔培养板中。细胞于37℃、5%CO2环境中培养，每2天换一次液，培养3d～4d后使用[2]。 　　1.5.3实验分组缺氧模型组：正常培养3d的心肌细胞弃去培养液，换成无糖DMEM液，用无菌液状石蜡封住液体表面，使细胞缺氧[3]。对照组：心肌细胞不做任何处理，正常条件培养。山茱萸总苷干预组：细胞缺氧处理之前24h在培养液中加入0.49g/L的山茱萸总苷，缺氧培养的同时亦加入0.49g/L的山茱萸总苷进行干预。各组设1h、2h、3h、5h4个时间点进行指标观察。 　　1.5.4心肌细胞的鉴定按照SABC抗α横纹肌肌动蛋白试剂盒说明方法：将培养3d的细胞爬片，用4%多聚甲醛固定30min。然后用30%H2O21份+纯甲醇50份混合液室温浸泡30min后蒸馏水洗1次～2次，滴加5%BSA封闭液，室温20min，甩去多余液体，滴加1∶100稀释的一抗（小鼠抗大鼠αSarcomericactin），对照组用蒸馏水代替一抗，37℃孵育1h，PBS洗2min×3次。滴加生物素化山羊抗小鼠IgG，室温20min，PBS洗2min×3次。滴加试剂SABC，37℃20min，PBS洗5min× 　　1）为广东省中医药管理局课题基金资助项目（No4次。二甲苯透明，中性树胶封片[4]。 　　1.5.5TUNEL检测心肌细胞的凋亡率将培养的细胞爬片，4%多聚甲醛固定，室温孵育10min后，将玻片浸没在1×TBS溶液中，室温孵育15min。每个样本玻片上滴加50μL～100μL浓度为20μg/mL的蛋白酶K溶液，室温孵育5min。用1×TBS溶清洗样本2次～3次。滴加100μL×TdT平衡缓冲液，室温孵育20min后，在每个样本上立即滴加60μLTdT标记反应混合物，置于湿盒中于37℃孵育90min。将样本玻片置于1×TBS溶液中室温孵育1min。去掉多余液体，换用新鲜1×TBS溶液室温孵育1min，重复1次。用滤纸轻轻擦掉样本周围及背面的TBS溶液，逐滴滴加MountingMedia封片剂并盖上盖玻片。