6—羟基多巴胺损伤早期帕金森病大鼠模型实验研究.docVIP

6—羟基多巴胺损伤早期帕金森病大鼠模型实验研究 　　摘要：目的 观察6-羟基多巴胺（6-hydroxydopamine， 6-OHDA）损伤早期帕金森病（Parkinsons disease， PD）大鼠行为学及黑质部位组织学的变化特点。方法 偏侧前脑内侧束注射6-OHDA，通过阿扑吗啡诱发旋转试验、跨步调节试验和姿势部对称试验评估注射后24 h、7 d及28 d大鼠行为学的变化；通过免疫组织化学染色观察黑质部位酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase， TH）阳性细胞计数的变化。结果 6-OHDA组大鼠跨步调节试验评分减少，姿势不对称试验评分增加，阿扑吗啡诱发大鼠向损伤对侧旋转，与对照组和假手术组比较统计学差异显著（P 　　关键词：帕金森病；大鼠；6-羟基多巴胺 　　帕金森病（PD）是常见的中老年人中枢神经系统退行性疾病，其病因及发病机制目前尚不清楚， 研究认为可能与遗传、环境因素、线粒体功能障碍、兴奋性氨基酸、氧化应激、过多的自由基形成???神经生长因子缺乏等有关，是多种机制协同作用的结果[1-2]。偏侧6-OHDA损毁模型是目前使用最多的PD动物模型之一，其在症状、病理、生化方面的表现与人类PD有不少相似之处，但该模型的损伤程度因6-OHDA的剂量、浓度、注射位点不同而存有争议，特别是对损伤早期大鼠行为学方面的观察比较缺乏。本实验通过观察6-OHDA损伤早期PD大鼠行为学及黑质部位组织学的变化特点，验证损伤早期PD大鼠模型的稳定性及可靠性。 　　1资料与方法 　　1.1一般资料 选用健康雄性SD大鼠40只， 体重 250～300 g，由南通大学实验动物中心提供。6-OHDA、抗坏血酸干粉剂、盐酸阿朴吗啡（apomorphine）、抗酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase， TH）抗体均购于Sigma公司。 　　1.2方法 　　1.2.1实验动物分组 40只SD大鼠随机分为三组：①空白对照组（n=8）；②6-OHDA模型组（n=24）：分为24 h组（n=8）、7 d组（n=8）和28 d组（n=8）3个亚组；③假手术组（n=8）。 　　1.2.2动物模型 模型组大鼠用复合麻醉剂（含戊巴比妥钠、丙二醇、硫酸镁等，0.25 mL/100 g体重）腹腔注射麻醉，待大鼠后肢回缩反射及角膜反射消失后，将其头部水平位固定在脑立体定位仪上，剪除颅顶鼠毛，碘酒、酒精消毒皮肤，沿中线切开一长约2cm切口，充分暴露前囟，参照Paxinos Watson（1996）《大鼠脑立体定位图谱》确定左侧前脑内侧束（mfb）三维坐标位置，选取mfb区坐标：前囟后2.8 mm，中线左侧2.0 mm，硬膜下8.2 mm。根据注射位点确定钻颅部位，手术刀尖小心钻开一直径约2 mm颅骨孔，微量进样器缓慢进针至靶点，留针10 min，以9 ng/s的速度注入2 μg/μL 6-OHDA 4 μL（含0.02%抗坏血酸），注射完毕后留针5min，以1mm/min的速度退针。手术完毕，用明胶海绵堵塞颅骨孔，适量青霉素涂敷创口，消毒缝合皮肤，放回笼中饲养。并于24 h、7 d、28 d分别检测大鼠行为学和组织学的改变。假手术组同法予含0.02%抗坏血酸的生理盐水4 μL，空白对照组不作任何处理。 　　1.2.3行为学检测 　　1.2.3.1跨步调节试验[3] 将大鼠身体的后半部分拖起 ，并使大鼠身体重量仅由一侧前肢支撑 ，记录10s内大鼠这一前肢走步次数 ，然后同法检测另一前肢的情况，以损伤对侧前肢行走次数所占比例（损伤对侧前肢行走次数/（损伤对侧前肢行走次数+损伤侧前肢行走次数））为评价指标。 　　1.2.3.2姿势不对称性试验[4] 握住鼠尾的中后部将其提起，悬空于实验台上方约10 cm处，使大鼠头向下处于垂直状态， 以其偏离垂直轴不超过10°为垂直位（标准位），记录大鼠头或上身左右摆动的情况，以摆动偏离垂直位并再返回到垂直位记数为1次。观察45 s内大鼠头或身体转动的方向和次数，以向损伤对侧摆动的次数所占比例（损伤对侧摆动的次数/（损伤对侧摆动的次数+损伤侧摆动的次数））为评价指标。 　　1.2.3.3阿扑吗啡诱发旋转试验 模型组分别于术后24 h、7 d、28 d于动物腹腔内注射阿扑吗啡0.5 mg/Kg 诱发大鼠向右侧（健侧）旋转，于阿扑吗啡注射后5 min开始记录，持续记录30 min。以24 h诱发旋转次数210次/30 min为合格模型。 　　1.2.4组织学检测 　　1.2.4.1动物灌注、固定、取材、切片 各组大鼠在最后一次行为学检测后，用复合麻醉剂麻醉，剪开大鼠胸腔，经主动脉快速灌注生理盐水（37℃）150～200 mL冲洗，至大鼠肝脏发白，流出液基本无色为止。随即灌注4%甲醛（4℃）先