胰岛素干预对白消安致小鼠生精细胞耗损恢复效果研究.docVIP

胰岛素干预对白消安致小鼠生精细胞耗损恢复效果研究 　　【摘 要】目的：研究胰岛素对化疗致不育小鼠生精细胞的恢复效果，明确胰岛素促进在体精原干细胞再生的效果。方法：4周龄雄性C57小鼠腹腔注射白消安（30mg/kg），注射后4周按60?g/kg体重剂量腹腔注射胰岛素进行干预，每天一次连续注射7天。在干预后第4周收集睾丸，检测睾丸重量、通过HE染色检测生精小管中生殖细胞恢复情况；通过RT-PCR检测GDNF和SCF基因表达评价胰岛素注射对小鼠精原干细胞微环境的影响。结果：在胰岛素干预后第4周，睾丸重量明显得到恢复，生精小管中上皮细胞数量明显得到恢复，精原干细胞微环境中再生因子GDNF和分化因子SCF表达水平稳定。结论：胰岛素干预可以促进化疗致精原干细胞耗竭小鼠睾丸中生精细胞数量明显恢复，且维持了精原干细胞微环境中再生分化调控的平衡关系。 　　【关键词】胰岛素；化疗；生精细胞；精原干细胞微环境 　　【中图分类号】R446 【文献标识码】A 【文章编号】1004—7484（2013）11—0018—02 　　男性不育症的治疗一直是困扰许多家庭和泌尿男科医生的疑难问题。随着生殖医学、体外受精和显微操作助孕技术的发展，特别是卵胞质内单精子注射（Intracytoplasmic Sperm Injection，ICSI）和显微外科技术的逐渐普及，男性不育症的治疗逐渐由传统的药物治疗转换到辅助生殖领域。但是新近的研究不断发现一些非梗阻性无精子症患者如青春期前的淋巴瘤或白血病等患者接受全身大剂量化疗后失去生育能力者，由于睾丸和附睾内没有单倍体生殖细胞，使ICSI技术的应用受到限制。已有研究表明，化疗药物白消安是一种烷化剂，能够杀死体内精原干细胞，从而使得精子发生耗竭。40mg/kg体重白消安单次腹腔注射4周后小鼠睾丸内几乎所有精原干细胞都被杀死，精子发生中断，造成不育[1，2]。通过治疗恢复放化疗患者体内精子发生成为治疗该类不育的关键。本研究对化疗不育小鼠腹腔注射胰岛素，探索外源胰岛素对化疗后不育小鼠睾丸内生精细胞恢复效果。 　　1 材料与方法 　　1.1实验动物：4周龄C57雄性小鼠，购自宁夏医科大学实验动物中心，在恒温条件下（20-25C）饲养，光照周期为12 h有光，12 h无光，自由采食饮水。 　　1.2白消安处理：4周龄C57雄性小鼠，分别按40mg/kg体重和30mg/kg体重两种剂量腹腔单次注射白消安，制备精原干细胞高剂量白消安和低剂量白消安损伤模型[2，3]。注射时首先将白消安溶解于二甲基亚砜（DMSO）中，然后用等体积水稀释后进行腹腔注射，对照组小鼠腹腔注射相应剂量DMSO与水的混合物。 　　1.3胰岛素干预：白消安处理后4周，低剂量白消安损伤模型组小鼠进行胰岛素干预处理，既按照60μg/kg体重剂量腹腔注射胰岛素，每天注射1次，连续注射7天。高剂量白消安损伤模型组小鼠不进行胰岛素干预。 　　1.4切片HE染色：胰岛素干预后4周，将对照组、白消安处理组以及胰岛素干预组小鼠脱臼处死，消毒，取出一侧睾丸，立即投入boin固定液（75ml苦味酸，25ml甲醛溶液，5ml冰醋酸）中，固定48h。然后脱水，透明，浸蜡，包埋和切片。石蜡切片脱蜡，染色，脱水，最后中性树脂封片。在光学显微镜下检查各组小鼠睾丸组织睾丸精细小管内生殖细胞的变化。另一侧睾丸用于RNA提取。 　　1.5 RT-PCR检测基因表达情况：胰岛素干预后4周，收集对照组、白消安处理组以及胰岛素干预组一侧小鼠睾丸，提取总RNA，纯化（除去RNA中DNA），反转录。反转录引物设计及合成是根据GenBank中小鼠β-actin、GDNF及SCF的cDNA序列，采用Oligo 6.0软件设计引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司北京合成部合成（表1）。反转录产物cDNA PCR扩增后进行琼脂糖凝胶电泳，采用mage-Pro Plus 6.0（IPP）软件对泳带进行灰度分析。 　　1.6统计学方法：各组间精原细胞增殖系数以及GDNF和SCF基因表达水平采用SPSS软件进行单因素方差分析（one-way ANOVA）。P0.05）。胰岛素干预后4周，胰岛素对生精小管中支持细胞表达的精原干细胞微环境再生因子GDNF和分化因子SCF基因表达水平都没有影响。 　　图3.胰岛素干预后4周对照组、低剂量白消安损伤模型组以及胰岛素干预组小鼠睾丸中GDNF和SCF mRNA表达情况.A.RT-PCR凝胶图.B.RT-PCR凝胶图灰度分析，SCF和GDNF在对照组、低剂量白消安损伤模型组以及胰岛素干预组3个组间表达差异不显著.n=6. 　　3 讨论 　　本研究发现，胰岛素干预可以使得低剂量白消安造成精原干细胞损伤小鼠精子发生得到明显恢复，干预治疗后精原干细胞微环境维持