凉血化瘀方拮抗内质网应激引起L02肝细胞凋亡作用及机制研究.docVIP

凉血化瘀方拮抗内质网应激引起L02肝细胞凋亡作用及机制研究 　　[摘要] 内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS） 启动的细胞凋亡是近年才发现的一种新的凋亡途径，本研究从ERS途径探讨凉血化瘀方对肿瘤坏死因子α（TNF-α）和D-氨基半乳糖 （D-GalN）所致肝细胞凋亡的保护作用。研究发现，TNF-α和D-GalN可明显抑制L02肝细胞增殖，诱导细胞凋亡，使细胞质内游离钙离子含量明显上升，并使ERS凋亡相关信号分子磷酸化PERK，磷酸化elF2α，cleaved Caspase-12，GRP78，CHOP的蛋白表达显著增加。不同浓度的凉血化瘀方作用后，与TNF-α/GalN损伤组相比，可显著减轻L02肝细胞的增殖抑制、减少细胞的凋亡，抑制细胞质内游离钙离子含量的增高，并使磷酸化PERK，磷酸化elF2α，cleaved Caspase-12，GRP78，CHOP的蛋白表达量呈逐渐下降的趋势。这些发现说明：凉血化瘀方对TNF-α和D-GalN所诱导的肝细胞凋亡具有抑制作用，其机制可能与维持内质网腔钙稳态平衡和下调ERS凋亡相关信号分子磷酸化PERK，磷酸化elF2α，cleaved Caspase-12，GRP78，CHOP的表达有关。 　　[关键词] 凉血化瘀方；肝细胞凋亡；内质网应激 　　凉血化瘀方是在叶天士温病“凉血散血”基本治法的基础上，结合多年临床治疗经验和重型肝炎瘀热相搏的病理特点而确立的方药，具有清热养阴、凉血化瘀、泻火解毒的作用[1-2]，方药通过正交设计优选最终由生地黄、制大黄、赤芍组成。前期研究结果显示凉血化瘀方对重型肝炎和实验性肝衰竭确有较好的防治作用，对肝细胞凋亡有明显的干预作用，初步探明了凉血化瘀法防治肝衰竭的作用机制是通过抗肝细胞凋亡保护肝细胞、减轻肝损伤而发挥良好的治疗作用[3-5]。过度的内质网应激（ERS）可启动细胞凋亡，这一条信号转导通路被认为是除死亡受体活化和线粒体损伤外又一条新的介导细胞凋亡信号传导的通路[6]。本实验拟在前期研究的基础上，利用肿瘤坏死因子α（TNF-α）和D-氨基半乳糖 （D-GalN）所诱导的肝细胞凋亡模型，观察凉血化瘀方对内质网腔钙离子含量的调控，以及对ERS凋亡相关信号分子磷酸化PERK，磷酸化elF2α，cleaved Caspase-12，GRP78，CHOP蛋白表达的影响，以期进一步揭示该方抗肝细胞凋亡的机制。 　　1 材料 　　1.1 细胞株 人正常肝细胞株L02购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库。 　　1.2 药材 凉血化瘀方药物组成：赤芍、生地黄、制大黄。饮片在安徽省医药公司购买，由南京中医药大学中药鉴定教研室鉴定，按照2005年版《中国药典》一部各中药项下要求，进行相关质量分析包括主要成分含量测定，确保所用饮片质量符合药典的规定。称取赤芍300 g、生地黄200 g、制大黄200 g置不锈钢锅中加水3 000 mL浸润1 h，然后置电炉上加热煎煮3次，煎煮时间分别为1 h，40 min，40 min，过滤合并滤液，浓缩，制成含生药量1 g·mL-1的母液，离心取上清，0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，然后用无血清的培养液稀释成高、中、低剂量分别为1，0.1，0.01 g·L-1备用（前期细胞毒性试验结果显示，当凉血化瘀方质量浓度高于1 g·L-1时，L02细胞活性显著下降，而在0.1～1 g·L-1时对细胞活力无明显影响）。 　　1.3 试剂 DMEM高糖培养基、胎牛血清、培养基瓶、细胞培养瓶、6孔板、96孔板、胰蛋白酶、DMSO等均购自Gibco公司；D-氨基半乳糖（D-GalN），Fura-2购自Sigma公司；人重组 TNF-α购于 Cytolab/PeprotechAsia公司；CCK-8 细胞增殖与毒性检测试剂盒购于上海碧云天公司；Annexin Ⅴ-FITC 凋亡检测试剂盒购自Invitrogen公司；cleaved Caspase-12，GRP78，CHOP，β-actin一抗和相应二抗均购自Santa Cruz公司；phospho-PERK，PERK，phospho-eIF2α，eIF2α一抗和相应二抗购自CST公司；ECL发光试剂购自Pierce公司。 　　1.4 仪器 电子天平（BP221S， Sartorius）、倒置显微镜（重庆光学仪器厂）、恒温孵育箱（3111 型，Thermo）、 超低温高速离心机（3K-15，Sigma）、荧光显微镜（TE 2000-S，Nikon）、酶标仪（MK3，Thermo）、高内涵细胞分析系统（Thermo Fisher Scientific）、多功能核酸蛋白测定仪（BioSpecMiNi，Shimadzu）。 　　2 方法 　　2.1