不同工艺提取竹节参皂苷粗提物毒性及其抗炎作用初步研究.docVIP

不同工艺提取竹节参皂苷粗提物毒性及其抗炎作用初步研究 　　摘要：目的 比较不同工艺提取的竹节参皂苷粗提物的毒性及抗炎效果。方法 采用不同工艺分别制备竹节参皂苷粗提物样品1、样品2、样品3、样品4、样品5、样品6，然后用不同工艺、不同浓度的样品处理RAW264.7细胞，显微镜下观察细胞形态，噻唑蓝（MTT）法检测细胞活力，一氧化氮（NO）试剂盒检测RAW264.7细胞NO释放量。结果 不同样品作用于RAW264.7细胞毒性从小到大依次为：样品4样品5样品2样品6样品1样品3。结论 6种不同提取工艺得到的竹节参皂苷粗提物中，泡沫分离法提取的竹节参皂苷粗提物毒性最小，抗炎效果最好。 　　关键词：皂苷；提取工艺；竹节参皂苷粗提物；抗炎；细胞活力 　　竹节参及其活性成分竹节参总皂苷具有抗炎、镇痛、免疫调节、抗氧化活性等多种药理活性，且不同提取方法对竹节参皂苷生物活性的影响很大[1-5]。本研究采用不同工艺提取竹节参中的皂苷成分，并建立脂多糖（LPS）致RAW264.7细胞炎症模型，对竹节参不同工艺提取的皂苷粗提物的毒性及抗炎活性进行了初步研究，以期为竹节参提取工艺及深入研究提供实验依据。 　　1 实验材料 　　1.1 药物、细胞与试剂 　　竹节参采于湖北恩施椿木营竹节参种植基地，经三峡大学湖北省天然产物研究与利用重点实验室邹坤教授鉴定为五加科人参属植物Panax japonicus C.A.Mey。小鼠单核巨噬白血病细胞株RAW264.7购于中国科学院上海细胞库。DMEM高糖培养基，Gbico公司，批号884684；胎牛血清，杭州四季清公司，批号100607；LPS（B5：O55），Sigma公司，批号110M4086V；一氧化氮（NO）检测试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司，批号S0021-3。 　　1.2 仪器 　　NU-4750E 型二氧化碳培养箱（Nu Aire公司）；SW-4T-2F洁净工作台（上海博讯实业有限公司医疗设备厂），CKX41倒置显微镜（日本奥林巴斯公司），TD25-WS多管架自动平衡离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司），Thermo全波长酶标仪（芬兰，TECAN INPINIFETMF 200）。 　　2 实验方法 　　2.1 样品制备 　　2.1.1 乙醇加热回流提取法 参照文献[6]方法。竹节参药材100 g，10倍量60%乙醇加热回流提取3次，2 h 1次，合并提取??并减压回收溶剂至无醇味，80 ℃水浴，浓缩至原药材质量5倍，滤除不溶亲脂性杂质，上清液用水饱和正丁醇等量萃取3次，回收正丁醇，然后加入适量85%乙醇溶液溶解竹节参总皂苷粗提物，并不断搅拌缓慢加入丙酮，常温静置，待沉淀完全析出，3500～4000 r/min离心15 min，收集沉淀物，并用适量丙酮洗涤，减压真空干燥，得提取物粉末样品1。 　　2.1.2 乙醇超声提取法 竹节参药材100 g，置锥形瓶中，加入60%乙醇500 mL，超声处理（功率250 W，频率50 kHz）40 min，摇匀，滤过，重复提取3次，合并滤液，回收溶剂，减压真空干燥，得提取物粉末样品2。 　　2.1.3 水饱和正丁醇超声提取法 竹节参药材100 g，置锥形瓶中，加入水饱和正丁醇500 mL，超声处理（功率250 W，频率50 kHz）40 min，摇匀滤过，重复提取3次，合并滤液，回收溶剂，然后加入适量85%乙醇溶解竹节参总皂苷粗提物，并不断搅拌缓慢加入丙酮，常温静置，待沉淀完全析出，收集沉淀物，并用适量丙酮洗涤，减压真空干燥，得提取物粉末样品3。 　　2.1.4 泡沫分离提取法 竹节参药材100 g，10倍量纯水加热回流提取3次，提取液浓缩至500 mL，调pH值至4.88，加入到泡沫分离装置中，控制气体流速为400 mL/min，进行分离，收集泡沫，乙醇消泡，分离结束后挥干溶剂，减压真空干燥，得提取物粉末样品4。 　　2.1.5 水提醇沉提取法 竹节参药材100 g，10倍量双蒸水提取3次，2 h 1次，合并滤液浓缩至原药材质量的5倍，加60%乙醇静置过夜，悬浊液于3500 r/min离心15 min，上清液水饱和正丁醇等量萃取3次，回收正丁醇，然后加入适量85%乙醇溶液溶解竹节参总皂苷粗提物，并不断搅拌缓慢加入丙酮，常温静置，待沉淀完全析出，收集沉淀物，并用适量丙酮洗涤，减压真空干燥，得提取物粉末样品5。 　　2.1.6 大孔吸附树脂提取法 竹节参药材100 g，10倍量双蒸水提取3次，2 h 1次，合并滤液后浓缩至原药材质量的5倍，加95%乙醇至乙醇终浓度为60%，静置过夜，悬浊液于3500 r/min离心15 min，上清液水饱和正丁醇等量萃取3次，回收正丁醇。然后用60%乙醇洗脱竹节参总皂苷粗提物，过大孔吸附树脂纯