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ECLIA反应过程 在电阳极上 1.TPA失去电子氧化为阳离子自由基TPA，二 价（基态）三联吡啶钌被氧化为三价的三联吡 啶钌 2. 阳离子自由基TPA性质不稳定，自发地失去 一个质子变成自由基TPA（还原剂） 3. 自由基TPA将一个电子给三价的三联吡啶钌 ，从而生成二价的三联吡啶钌（激发态）， TPA则分解为二丙胺和丙醛 4. 激发态二价三联吡啶钌发射波长620nm光子，重 新生成基态的二价三联吡啶钌 5. 上述过程周而复始，只消耗TPA 时间分辨荧光免疫分析（TrFIA） 镧系元素（如铕Eu）经激发后能发出特征性荧光，其荧光寿命较一般干扰荧光长数倍，故称时间分辨 如：经0.5μs （340nm）脉冲光激发，延迟 400 μs ，用613nm检测并记录荧光强度 400μs ，间歇200 μs 再次激发，每一工作 周期仅1ms，每秒钟可重复检测1000次 时间分辨荧光检测的基本原理示意图 荧光衰退时间 铕：730000 ns 钐：50000 ns 一般荧光物质：10 ns 铕的荧光 镧系元素 镧系元素共有15种，应用在时间分辨荧光免疫技术种有四种 钐（Sm），铕（Eu），镝（Dy），鋱（Te） 镧系元素荧光重要特点： 1. 极长的荧光衰退时间 铕：730000ns钐：50000ns 一般荧光物质： 10ns 2. 200nm以上的Stokes位移 铕：激发光340nm，发射光613nm 钐: 激发光340nm，发射光561 597 642nm 3.狭窄的发射峰 4.解离-增强技术可使其荧光性提高100万倍 基本原理 镧系元素（15）：铕（Eu），钐（Sm），镝（Dy），鋱（Te） Eu + Eu Eu + 增强液 + Eu DELFIA技术的特点 技术 特点 检验先进性 时间分辨 波长分辨 将特异性荧光与非特异性荧光分离开 零背景 高特异性 解离-增强 荧光性大大提高 稳定的荧光螯合物 线性范围更宽 重复性更好 低分子量原子标记 标记位点多可达20个 对标记物的结构与活性影响小 无衰变 受环境影响小 灵敏度更高 高稳定性，高精确度 试剂保质期至少一年 标准曲线保留时间长 同一批次只需两点定标 多标记 单，双，三，四标记 一个试剂盒可同时测多个项目 非放射性标记免疫与放 射性标记免疫分析的比较 试剂稳定，有效使用期长，可达6～12月 灵敏感度高，可达10-14－18g 标准曲线稳定，可达2～4周，节省试剂 自动化程度高，减少加样误差 出结果迅速，适合急诊检测 缺点：仪器及试剂成本较放免高，试剂与仪器不能兼容差，不利于市场竞争 思考题 RIA的基本原理 RIA操作流程 RIA的质控指标 RIA与IRMA主要区别 受体的特点及与配基结合的基本特征 非放射性标记免疫分析的优点 RIA的分离方法 指分离标记抗原抗体复合物（B）和游离标记抗原（F）的方法。 根据使用的分离剂不同可以分为： 非特异性分离方法：利用物理、化学或生物化学的方法如吸附、过滤、沉淀等。 特异性分离方法：利用免疫反应的特异性来进行分离的方法。 常用的分离方法有双抗体法 固相法等 分离方法的要求 分离完全、快速。 不影响免疫反应的平衡，即是要求在分离过程中不使抗原-抗体复合物解离或形成新的复合物。 受环境因素（温度、PH值等）的影响小。 操作简便，分离剂来源丰富、价廉。 标准曲线的拟合方式 标准曲线是衡量待测样品中配体浓度的客观尺度和基准 反映检测质量的指标 标准曲线要最大限度地反映量效关系 便于自动化分析，使用灵活 每一批分析必须做一条标准曲线。 WHO推荐的数据处理模型是四参数单位点质量作用模型和四参数logistic模型 RIA特点 特异性强 灵敏度高，可检测10-9～10-12 g水平 稳定性好 操作简便 适于多种生物活性物质 RIA测量的是免疫活性 误差的分类和来源 根据来源不同的误差，可以把实验中产生的误差分为两类： 系统误差 随机误差 是由于试剂、仪器或操作方法上一个固定的缺陷而造成整批结果倾向性的偏差，影响了结果的正确性。如标准品不标准、加样器不准等 系统误差引起的测定结果的偏差是固定的偏大或偏小。 系统误差是可以避免的。 系统误差 是由于实验过程中各种偶然因素造成同一样品多次测定的结果不一致。如加样、分离、放射性测量等 误差的出现是随机的，与真实值的偏离是双向性的，可大可小。 随机误差无法避免。 随机误差 质量控制 质量控制就是使用合适的方法以检查、表示和消除来自试剂药盒和测量体系的误差，并使这种误差降低到某一允许水平。 具体作用有： 1．检查误差的程度，决定测定结果的取舍。 2．识别误差的来源并