免疫浊测定.pptVIP

免疫浊度测定是将液相内的沉淀试验与现代光学仪器和自动分析技术相结合的一项分析技术。 当可溶性抗原与相应抗体特异结合，二者比例合适时，在特殊的缓冲液中它们快速形成一定大小的抗原抗体复合物，使反应液体出现浊度。利用现代光学测量仪器对浊度进行测定，可推算出免疫复合物的量，从而检测抗原含量。 本实验以微量终点透射免疫比浊法检测血清IgG含量为例。 实验方法 3.加抗原：将聚苯乙烯反应板编号，每个微孔内分别加入不同稀释度IgG标准品（共7孔）、待检血清各10μl，留1个空白孔不加。 4.加抗体：加入稀释好的1:10的抗人IgG血清200μl。加样情况详见下表。 实验方法 6.比浊：取出后用空白孔（含稀释抗血清210μl，不含待检样品）调零，用酶联免疫检测仪测405nm吸光度值。 7.绘制标准曲线：以IgG含量为横坐标，相应吸光度值为纵坐标，制作标准曲线。 免疫浊度测定 （Immunoturbidimetry） 原 理 透射比浊法和散射比浊法光路 检测器A 检测器B IC I0 Iθ I θ 透射比浊法 散射比浊法 当复合物＜3×106dal， I≈Iθ;θ＜90°，散射光的量代表IC的量。 免疫浊度测定类型： 1.透射比浊法（transmission turbidimetry) 2.散射比浊法（nephelometry) ①终点散射比浊法(endpoint nephelometry) ②速率散射比浊法(rate nephelometry) 返回 当一定波长的光线通过抗原抗体反应混合液时，被其中的免疫复合物反射、吸收而减弱。在一定范围内，透射光被吸收的量（吸光度值）与免疫复合物呈正相关，而免疫复合物的量与相应抗原和抗体的量呈函数关系，当抗体量恒定时，根据所测吸光度值即可计算出待检抗原量。 实验原理 试剂 1.羊抗人IgG抗血清、 2.IgG标准品（含量10g/ L ） 、待检血清 3.稀释液（PEG 6000 43.5g、NaF 21.0g、NaCl 9.0g、NaN3 1.0g，加蒸馏水溶解后补水至1000ml，3号玻璃滤器过滤，室温保存） 仪器 水浴箱、酶联免疫检测仪、微量振荡器 。 材料 96孔聚苯乙烯反应板、微量加样器等 。 实验器材和材料 1.抗原抗体反应 2.测定浊度 3.绘制标准曲线 操作步骤： 1.稀释抗IgG：用稀释液将羊抗人IgG抗血 清作1：10稀释（总量2.5ml）。 2.稀释IgG标准品： 将IgG标准品用稀释液稀释成各种不同浓度(1:2,1:4,1:8,1:16,1:32,1:64) 。 实验方法 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 各管IgG标准品稀释法 轻摇 稀释度 抗原 浓度 （10 g/ L ） 稀释液 50 50 50 50 50 50 50 1:64 1:128 50 1：2 1：4 1：8 1：16 1：32 1：64 1：128 各抗原稀释度 8 7 6 5 4 3 2 1 孔编号 0 210 10 210 10 210 10 210 10 210 10 210 10 210 10 210 加抗原量 （ul） 各孔总量 210 200 200 200 200 200 200 200 1:10抗体 （ul） 5.微量振荡器上混匀1min，置37℃水浴箱30min。 表1 各孔加样量 抗原浓度 OD值 待检样品中IgG含量可根据所测吸光度自标准曲线上换算。 结果判断 1.抗人IgG血清要求效价高（双向扩散效价1:32以上）而且特异性强。 2.标准曲线须与待检样品同时制备，不可一次做成，反复应用。 3.操作中最好设置质控血清孔，建立室内质控，以保证实验的精确度。 注意事项 免疫比浊法的影响因素： 1.抗原抗体的比例，应保持抗体过量，避免因抗原 过量引起“钩状效应”。 2.抗体的质量：要求特异性强、效价高、 　　　　　　　亲和力高、使用R型抗体 3.抗原抗体反应的溶液：PH值、离子强度 本法是测定IgG的一种微量比浊法，由于加入了促聚剂聚乙二醇，提高了复合物的形成速度和检测敏感性，除应用于血清IgG测定外，还可以用于其他体液如脑脊液中IgG含量的测定。 应用与评价 基本原理 散射比浊法是指沿水平轴向反应液照射一定波长的光，当光线通过反应体系时，由于抗原抗体反