生物化第二章后.ppt

* 缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。 * 尽管结晶并不能保证蛋白质一定是均一的，但只有某种蛋白质在溶液中数量上占优势时才能形成结晶。结晶过程本身也伴随着一定程度的纯化，而重结晶又可除去少量杂质的蛋白质。 结晶是进行X射线晶体学分析所要求的，只有获得蛋白质晶体才能对它进行X射线结构分析。 * 蛋白质分子最明显的特征之一是颗粒大，并且不同的蛋白质在分子大小方面是不同的，因此可以利用一些较简便的方法是蛋白质和小分子的物质分开，并使蛋白质混合物也得到分离。 * 凝胶是有网孔的分子 * 将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子（如硫酸铵的SO4和NH4)有很强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之“失水”，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样，因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀；最先聚集的蛋白质是表面疏水残基最多的蛋白质 * 但有的蛋白质（如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白）在较高的温度（25度）比0度时溶解度低，更容易盐析。 * 带正电阴离子；带负电—阳离子 * 树脂是光滑的,中间没有网孔,只是外面带电荷 * * 是最目的明确的一种方法,只获得某一蛋白,但是要求明确能与分离蛋白特定结合的配体了解的比较清楚. 电泳 双向电泳： 2）离子交换层析法 纤维素离子交换剂（具有较松散的亲水性网状结构，有较大的表面积，大分子可以自由通过，容量大；纤维素糖残基上的羟基被取代的百分比较低，电荷密度比较小，所以洗脱条件温和，蛋白回收率较高） 离子交换剂有阳离子交换剂（如：羧甲基纤维素；）和阴离子交换剂（二乙氨基乙基纤维素；） 离子交换原理及流程示意图 4、亲和层析法(根据配体的特异性分离) 亲和层析法（aflinity chromatography）是分离蛋白质的一种极为有效的方法，是利用蛋白质分子对其配体分子特有的识别能力，即生物学亲和力，建立起来的一种有效分离蛋白质的方法。 亲和层析法的基本原理：把待纯化的某一蛋白质的特异配体通过适当的化学反应共价地连接到像琼脂糖凝胶一类的载体（载体能允许蛋白质通过）表面的功能基（-OH）上。一般在配体和多糖载体之间插入一段长度适当的连接臂或间隔臂，使配体和凝胶之间保持足够的距离，保证分离的分子与配体的结合。当蛋白质混合物加到填有亲和介质的层析柱时，待纯化蛋白结合，其余不结合，洗涤除去，被特异结合的蛋白质可用含游离的相应配体溶液把他从柱上洗脱出来。 亲合层析原理及流程示意图 5、高效液相层析（High performance liquid chromatograhy, HPLC） 是以层析的原理为基础，更高效 使用的固定相支持颗粒很细，因而表面积大，分辨率高； 溶剂系统采用高压，洗脱速度增大。 第五节 蛋白质的通性、纯化和表征 酸碱性质 胶体性质和沉淀性质 蛋白质的分离纯化 蛋白质分子的大小测定 1 凝胶过滤法测定分子大小 2 SDS测定相对分子 四 蛋白质分子的大小测定 蛋白分子大小 *第一节 蛋白质的构 件-氨基酸 *第二节 蛋白质的 共价结构 本章重点 氨基酸的分类 酸碱性质和等电点计算 化学反应:水合茚三酮和侧链SH 紫外吸收性质 分离:纸层析和离子交换 蛋白质的分类和功能多样性； 肽的结构特点和基本性质； 蛋白质一级结构 *第三节 蛋白质的三 维结构 第四节 结构与功能 的关系 本章重点 研究方法 构型 构象名词 二级结构 三级结构的特点 四级结构 维持各级结构的力 血红蛋白的结构和功能 肌红蛋白的结构和功能 分子病-镰刀型贫血 免疫反应: 两个系统及核心 免疫球蛋白结构 第五节 蛋白质的通 性、纯化和表征 本章重点 蛋白质的酸碱性质 蛋白质的胶体性质; 沉淀性质(可逆不) 盐溶和盐析 分离纯化方法和原理 根据蛋白质分子大小的差别的分离 根据蛋白质溶解度不同的分离 根据蛋白质带电性质进行分离 根据配体的特异性分离 * * * * * * 改变的蛋白导致在缺氧条件下红细胞的扭曲 镰刀型细胞疾病是非常重要的一种，为什么缺陷突变在这些人群中扩散的那么成功呢？答案是纯合条件下是致死的，但杂合可以产生足够的细胞