细胞工程-第六章 植物原生质体培养与体细胞杂交.pptVIP

第六章 植物原生质体培养和体细胞杂交 知识目标： 掌握原生质体的分离以及培养过程 理解原生质体培养过程中渗透压和激素的调控原理与技术 了解体细胞杂交的基本原理 掌握电融合和PEG融合的基本方法。 一、原生质体培养的意义 1.原生质体概念 原生质体(protoplast)：指除去细胞壁的细胞或是说一个被质膜所包围的裸露细胞。 亚原生质体(subprotoplast)：在原生质体分离过程中，有时会引起细胞内含物的断裂而形成一些较小的原生质体就叫做亚原生质体。它可以具有细胞核或没有细胞核。 核质体(nuclearplast)：由原生质膜和薄层细胞质包围细胞核形成的小原生质体。也称为微小原生质体(miniprotoplast)。 胞质体（cytoplast）：不含细胞核而仅含有部分细胞质的原生质体。 2.意义： ①获得再生植株； ②可以远缘体细胞融合，实现体细胞杂交。 二、原生质体分离的大致步骤 １．用于分离原生质体的材料准备 无菌试管苗叶片，上胚轴和子叶 培养细胞 ２．预处理与酶解 用黑暗处理，低温处理和不同光质照射等方法，可提高某些材料原生质体的产量和活力．不同植物及材料预处理的方法不同． 酶解 所需酶类：纤维素酶　半纤维素酶　果胶酶 渗透压稳定剂:A.糖溶液系统;B.盐溶液系统 酶解条件： A.一般在要求黑暗静止；难游离原生质体的材料，则置于摇床上，低速振荡。 B.酶解时间：不等，一般不超过24h。 C.酶解温度：25℃。 D.加入渗透稳定剂：糖溶液系统；盐溶液系统 E.酶解PH值：一般在5.6-5.8。 方法（一步法）： A.灭菌的叶片或子叶去掉下表皮，去下表皮的一面朝下放入酶液。 B.悬浮细胞培养物用尼龙网筛过滤后再加入酶液中。 ３． 原生质体的收集和纯化 沉降法 过滤：筛孔40-100微毫的滤网。 离心：500r/min, 5min。 再离心：先悬浮在洗液后离心，重复三次,培养基清洗 调原生质体培养密度 漂浮法 常用的漂浮剂为蔗糖. 梯度离心法 ４．培养前进行原生质体活性检测 三、原生质体的培养 （一）培养基 1．渗透压 常用的渗透压调节剂：甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等。原生质体的渗透压原则：培养基渗透压与细胞渗透压等渗。 2．无机盐 大量元素浓度；NO3－和NH4+的比例；Ca2+浓度 3．有机成分 维生素、氨基酸、糖及糖醇等，酵母提取物、水解酪蛋白。 4．激素 常用的激素：NAA、IAA、BA与2,4-D 5．pH值 (二)原生质体培养方法 1．液体浅层培养 此法是先把原生质体以一定的密度悬浮在液体培养基中，用吸管将悬浮液移到直径为60cm的平皿中使之形成一个浅层。 优点：培养基与空气接触面大、通气好，原生质体的代谢物易扩散，防止了有害物质积累过多而造成毒害。此外，转移培养物或添加新鲜培养基也方便，并便于观察和照相。 缺点：因原生质体不易集聚而影响培养。 ２．双层培养法 固体培养和液体浅层培养相结合的方法。先将含0.7％低熔点琼脂糖的固体培养基溶化后凝固于直径为6cm的培养皿内，再加入2ml原生质体与培养液的均匀混合物。开始1～2d需经常轻微摇动，使其均匀、不集聚。 该方法既具有较丰富的培养基，又不易干燥，且细胞分裂后可在固体培养基上生长和繁殖，为较好的培养方法。 ３．平板法培养 取1ml原生质体密度为4×105/ml悬浮液，与等体积已溶解的含有1.4%低熔点（40℃）琼脂糖的培养基均匀混合后，置于直径为6cm培养皿中，此时密度为2×105/ml，待凝固后，将培养皿翻转，置于四周垫有保湿材料的直径为9cm培养皿内。 用此方法得到的原生质体分布均匀，有利于定点观察，也有利于在部分材料污染时抢救未污染的部分。 (三)植板密度 原生质体培养的密度一般是1×104/ml至l×105/ml。 (四)培养条件 １．光照 新分离出来的原生质体应在散射光或黑暗中培养。 2．温度 原生质体的培养温度一般为25～30℃。 (五)原生质体的发育和植株再生 原生质体在合适的培养条件下，先再生形成新的细胞壁，然后再生细胞进行分裂形成细胞团和愈伤组织，最后通过愈伤组织或胚状体途径获得再生植株。 1．细胞壁再生 原生质体培养数小时后开始再生新的细胞壁，一至数天内便可形成完整的细胞壁。 2．细胞分裂和生长 原生质体一般培养2—7d后开始第一次分裂 ， 培养一周后再生细胞进行第二次分裂，之后很快进行第三、四次分裂。培养二周后，形成多细胞的细胞团，三周后形成肉眼可见的小细胞克隆，大约六周后形成直径1 mm的小愈伤组织。 3．植株再生 原生质体培养形成愈伤组织以后，将其转到分化培养基上诱导器官形成或胚胎发生，使其长成完整植株。 总结原生质体分离