杀稻瘟菌素的异源表达及其生物合成机制的体内功能研究-微生物学专业论文.docx

杀稻瘟菌素的异源表达及其生物合成机制的体内功能研究摘要杀稻瘟菌素是一类肽核苷类抗生素。自1958年被发现以来，它被大规模用于取代汞制剂农药来防治稻瘟病、白粉病。此外，由于杀稻瘟菌素在真核生物基因工程中可以有效地筛选突变株，它被广泛的应用于生物研究。杀稻瘟菌素的生物合成基因簇于2003年被报道，但是由于杀稻瘟菌素的天然产生菌的遗传操作难以进行，几乎没有关于杀稻瘟菌素生物合成的体内研究的报道。因此目前报道的生物合成基因簇的完整性还有待商榷。我们通过构建杀稻瘟菌素天然产生菌S.griseochromogenes的基因组文库，并结合已发表的序列，运用染色体步移技术从基因组文库中钓取出了柯斯质粒7D11。测序结果表明，7D11包含了杀稻瘟菌素已发表的DNA序列及其下游的8.6kb的片段。进一步的生物信息学分析结果显示，这8.6kb序列中所包含的基因与杀稻瘟菌素生物合成并无关联。为了深入研究杀稻瘟菌素的生物合成机制，我们通过4次同源重组的方法，将7D11中的插入序列嫁接到了变铅青链霉菌S.lividansHXY16的染色体上，得到突变株S.lividansLL2。生测结果表明，LL2并不能对杀稻瘟菌素生测指示菌（红酵母）产生明显的抑制作用。进一步的发酵结果表明，突变株LL2发酵产物中包含了一种杀稻瘟菌素的衍生物‐去氨基羟化杀稻瘟菌素（deaminohydroxymildiomycin，OH‐BS）。生物信息学分析发现，在HXY16中的染色体存在一种可能的杀稻瘟菌素脱氨酶基因SLBSD。体外生化实验表明，大肠杆菌融合表达的蛋白SLBSD可以将杀稻瘟菌素转化为OH‐BS。出人意料的是，融合表达的SLBSD在体外不仅可以以杀稻瘟菌素为底物，它还可以转化另一种核苷类抗生素米多霉素以及杀稻瘟菌素合成的中间产物胞嘧啶葡萄糖醛酸（cytosylglucuronicacid，CGA）。而这两个化合物被确认是可以在野生型变铅青链霉菌中进行异源合成的。紧接着，我们在HXY16中敲除SLBSD后得到突变株S.lividansWJ1，其对于杀稻瘟菌素的抗性从大于200μg/ml下降到了100μg/ml。体内和体外的实验表明：SLBSD是天然存在于变铅青链霉菌染色体上的一个杀稻瘟菌素抗性基因。在嫁接有杀稻瘟菌素生物合成基因簇的菌株LL2中，我们通过敲除SLBSD得到突变株S.lividansWJ2。发酵结果显示，在WJ2中OH‐BS不再产生，并且WJ2可以正常的异源表达杀稻瘟菌素。这个结果进一步证明了WJ2中包含了完整的杀稻瘟菌素生物合成基因簇。为了深入的检测WJ2中产生的次级代谢产物，以及亚铁离子对杀稻瘟菌素生物合成的影响，将WJ2在种子/发酵培养基中进行发酵并用LC‐MS检测发酵液。检测结果表明，WJ2的发酵液中存在一个新的次级代谢产物。通过质谱以及二级质谱的分析，证实这个代谢产物为去甲基杀稻瘟菌素。为了探究造成去甲基杀稻瘟菌素积累的原因，我们探索了已报道的杀稻瘟菌素生物合成基因簇。生物信息学分析揭示blsL可能编码一个N‐甲基转移酶，因此推断blsL可能与去甲基杀稻瘟菌素的形成有关系。基因置换的结果表明，在blsL的被壮观霉素抗性基因置换的突变株变铅青链霉菌WJ3中不再产生杀稻瘟菌素，并且大量积累去甲基杀稻瘟菌素。同时，blsL基因回补菌株可以正常产生杀稻瘟菌素，证实在WJ3中不存在极性效应。在杀稻瘟菌素生物合成基因簇中，blsF的功能未知。通过BlastP搜索发现，BlsF与米多霉素生物合成基因簇中MilL有一定同源性。但是milL并不是米多霉素生物合成的必需基因。基因置换的结果表明，在blsF被壮观霉素抗性基因置换后的突变株变铅青链霉菌WJ4中，杀稻瘟菌素的产量大大提高。不仅如此，在未经纯化处理的WJ4的发酵液中还检测到了大量杀稻瘟菌素生物合成中间体CGA，进一步表明blsF可能是杀稻瘟菌素生物合成中一个途径专一行的调节基因。在杀稻瘟菌素生物合成基因簇中，blsE编码了一个RadicalSAM家族的蛋白，其功能未知。为了开展BlsE的体外生化实验，需要通过体内研究确定BlsE的底物。基因置换的结果表明，在用壮观霉素抗性基因置换了blsE的突变株变铅青链霉菌WJ5的发酵液中，杀稻瘟菌素不再产生，而杀稻瘟菌素生物合成的中间体CGA得到了大量积累。在米多霉素生物合成途径的研究中，blsE的同源基因milG的基因置换结果也得到了类似的结果。这证实了BlsE的底物为CGA，为之后BlsE的体外实验打下了基础。最近的体外生化实验表明，在杀稻瘟菌素生物合成中经历了一个脱羧‐再羧化的过程。但是在之前对基因簇的分析中，并未找到与羧化相关的基因。深入分析发现，BlsI可能是一个潜在的羧化酶。它与生物素羧化酶具有一定的同源性。基因置换的结果表明，在壮观霉素置换了blsI的突变