博尔纳病病毒hu-h1感染对人胶质母细胞瘤细胞的增殖及凋亡影响的初步研究-preliminary study on the effect of borna disease virus hu - h1 infection on proliferation and apoptosis of human glioblastoma cells.docxVIP

符号说明英文缩写BDV英文全称Borna disease virus中文全称博尔纳病病毒BSAbovine serum albumin牛血清白蛋白CCK8Cell Counting Kit-8细胞计数试剂盒DABDiaminobenzidine二氨基联苯胺DAPI4,6-diamidino-2-phenylindole4,6-二脒基-2-苯基吲哚DMEMDulbeccosmodificationofEaglemediums改良 Eagle 培养基ECLEnhanced chemiluminescence增强化学发光法FBSFetal bovine serum胎牛血清FFUFocus Forming Unit阳性集落FITCFluorescein isothiocyanate异硫氰酸荧光素IFimmunofluorescence免疫荧光kDkiloDolton千道尔顿MOImultiplicity of infection感染复数NNSnonsegmented negative single strand非阶段负链单股ODoptical intensity光密度值p40BDV nucleoproteinBDV 核蛋白PBMCperipheral blood mononuclear cell外周血单个核细胞PBSPhosphate Buffered Saline磷酸盐缓冲液PIproliferation index增殖指数PIpropidium Iodide碘化丙啶rpmround per minute每分钟转速WBwestern blot免疫印迹法1博尔纳病病毒 Hu-H1 感染对人胶质母细胞瘤细胞的增殖及凋亡影响的初步研究 摘要背景：博尔纳病病毒（borna disease virus, BDV）是一种非节段负 股单链 RNA 病毒（NNS），具有高度嗜神经性并以非细胞溶解的方式 在感染细胞中复制 BDV 能实验性感染许多像兔、猴直到鸡等范围内脊 椎动物。流行病学调查发现 BDV 的自然感染宿主范围也很广泛。文献 报道了在马、羊、兔、猴、猫、狗和骆驼中 BDV 感染造成的致死性脑 炎。无症状感染在世界各地多种动物物种中也有报道。因此 BDV 很可 能感染所有温血动物。大量的流行病学调查发现，人类的神经精神疾 病和 BDV 感染有一定联系，因此 BDV 又被称为“情感病毒”。感染新 生大鼠导致学习记忆能力下降，其神经病理学变化基础皮质萎缩、小 脑发育不良、海马齿状脑回颗粒细胞神经元的减少、小脑浦肯野细胞 的减少。BDV 诱导神经元的凋亡明确的分子机制目前还需进一步的研 究和确认。目的：本文通过 BDV 病毒 Hu-H1 株感染人脑胶质母细胞瘤 U87 细胞，对病毒感染后 U87 细胞增殖所率和凋亡情况作一个初步的研究， 对 BDV 与细胞的相互作用规律有一个初步的认识。方法：1 通过反复冻融持续感染 BDV 的 OL 细胞来获取病毒液。22.病毒液的浓度采用免疫细胞化学的方法检测 p40 蛋白阳性细胞集落，计算病毒液的滴度。3.采用 CCK8 试剂盒检测感染后 U87 细胞和未感染细胞在 1~7 天的增 殖情况。4.采用 Annexin V/PI 双染流式细胞仪检测感染和正常 U87 细胞在 1、3、5 天时细胞凋亡比例的变化。5.PI 单染流式细胞仪检测 U87 细胞感染后 24h 内周期有无阻滞情况。6.免疫印迹法 WB 检测 U87 细胞中凋亡相关蛋白 Bax 和 Bcl-2 在感染 后的变化。结果：1. 经免疫细胞化学显色方法测得 Hu-H1 滴度为 6× 10^4FFU/mL。2.BDV 感染 U87 后 3 天左右即可观察到 p40 蛋白的表达。说明 BDV可以持续感染 U87 细胞。3.经 CCK8 法检测，BDV 感染的 U87 细胞增殖速率在第 1 天时与对 照组无差异；在第 2~4 天时，其增殖速率低于对照组细胞，BDV 抑制了细胞的增殖；5~6 天时感染组细胞增殖速率开始加快，超过 了对照组，BDV 促进了细胞的增殖。4.BDV 对凋亡的影响：感染组在第 1 天时和对照组无差异；感染后第3 天，感染组细胞凋亡高于对照组，此时 BDV 促进了 U87 细胞的 凋亡；第 5 天时，感染组细胞凋亡又低于对照组，此时 BDV 抑制 了 U87 的凋亡。35.BDV 感染 U87 细胞后，细胞周期在血清饥饿 24h，此时感染组和对照组无差异，说明血清饥饿有效阻滞了周期。在 6h、15h 和 24h， 感染组的增殖指数都比对照组低，说明 BDV 在这段时间对细胞周 期有干扰作用，妨碍了细胞的生长增殖。6.Bcl-2 蛋白在第 1 天时感染组和对照组无差异；第 3 和 5 天，感染组表达水平低于对照组。Bax 蛋