哺乳动物细胞hek293-f瞬时表达人il-4-transient expression of human il - 4 in mammalian cell hek 293 - f.docxVIP

中文摘要中文摘要自1982年美国FDA批准首个基因工程药物——重组人胰岛素上市之后， 以重组蛋白药物为首的基因工程药物在近三十年来发展迅速。由于哺乳动物细 胞能对蛋白进行正确的折叠组装和翻译后修饰，这对于蛋白维持构象的稳定和 生物活性的发挥是至关重要的，因此哺乳动物表达系统成为生产重组蛋白药物 的首选工具。瞬时表达系统以其生产周期短，效率高，低投入的特点成为表达 研发过程中的药物蛋白候选基因或是结构、功能不明确的蛋白基因的最佳选择， 是一种快速、便捷的蛋白表达方法。虽然瞬时表达系统广泛用于重组蛋白药物的筛选和蛋白功能的研究，但是 相对于原核表达系统前者在蛋白表达水平上还是远远落后的。因此需要深入研 究如何提高瞬时表达系统的蛋白表达量。白细胞介素4(Interleukin．4，IL．4)是免疫系统效B和T淋巴细胞等效应 细胞成熟分化所必需细胞因子，除了在介导炎症过敏反应中发挥作用外，在肿 瘤、自身免疫等疾病的治疗和研究中都有重要作用。天然人IL．4分子为由129 个氨基酸(15 kDa)构成的蛋白质，糖基化在其肽链骨架上的2个糖基化位点 引入，分子内二硫键由其肽链上的6个半胱氨酸参与。目前基因重组IL．4主要 是采用E．coli表达，为非糖基化蛋白质，虽然保留了生物活性，但其活性和稳定 性应该与其糖基化形式有很大差异。另外，采用动物细胞表达，由多个半胱氨 酸参与的分子内二硫键形成不存在错配问题。本文以人IL．4作为研究对象，首先克隆构建了人IL．4真核表达载体，将 几种分泌能力强的信号肽编码序列通过PCR方法与IL．4基因融合，它们分别 为鼠抗体kappa轻链可变区的信号肽——Ig k-chain signal peptide，海洋桡足动物的荧光素酶的信号肽——Gaussia luciferase signal peptide，和一种人工信号肽，构建了一系列带有不同信号肽的表达载体。将这几种表达载体通过PEI介导的 瞬时转染在HEK 293．F细胞中进行表达，对信号肽进行优化。用ELISA的方 法来定量检测IL．4的分泌表达量，得出结果荧光素酶信号肽分泌表达IL．4的 能力最强。然后选取荧光素酶信号肽构建的表达载体，采用Box．Behnken设计对瞬时中文摘要转染条件进行优化，通过15组不同组合的实验和响应曲面分析(RSM)建立 了DNA浓度，PEI浓度和孵育时间三个影响因子与IL．4表达量之间的多元线 性回归模型：Y=198．02+32．77*A一54．25*B．7．90*C．4．55宰A水B．4．68*A木C+1 1．47*B木 C+2．74*0．1 17．19B‘．1．81术C‘(Rz=0．9522)。优化出瞬时转染的最佳转染条件 为：PEI浓度是6．1 gg／mL，DNA浓度为1．96 gg／mL，孵育时间为6．07 min。最后通过RSM与non．RSM法优化出的转染条件在150 mL摇瓶中进行对比实验，结果显示RSM法优化的转染条件能获得更大的IL．4蛋白表达量。 关键词：瞬时表达；IL．4；信号肽；Box．Behnken设计；HEK 293．FIIAbstractAbstractBiopharmaceuticals have experienced a rapid development in the last 30 years， since the first recombinant protein drug human insulin came into the market in 1 982． Compared to microbes such as E．coli，mammalian cells are the only hosts that can execute automatically in the right way protein folding，assembly and posttranslational modifications，which are critical to the biological activity and stability of a protein active．Mammalian expression systems therefore have become the preferred tools in producing recombinant proteins．Although stable expression systems，using cell lines such as CHO and NSO，are dominant in the large scale production by the biopharmaceutical industry，t