草鱼tnf-α和ifnγ2的克隆鉴定 重组表达及生物学功能的研究-cloning, identification, recombinant expression and biological function of tnf - α and ifn γ 2 in grass carp ( ctenopharyngodon idellus ).docxVIP

摘要摘要细胞因子是一类由免疫细胞及其它类型细胞合成或分泌的高活性、多功能的小分子蛋白质物质，能调节多种细胞的生理功能。肿瘤坏死因子???tumornecrosisfactor?,TNF-?)和干扰素???Interferon?,IFN?)在免疫功能和炎症反应中起关键调节作用，均为多效应的细胞因子。为了研究草鱼TNF-??和IFN??的分子结构和功能性质，本课题克隆获得草鱼TNF-??和IFN?2的cDNA全长序列，然后分别将其成熟肽克隆至pET30a(+)载体，构建BL21(DE3)-pET30a(+)-TNF-??和BL21(DE3)-pET30a(+)-IFN?2原核表达系统。通过优化诱导表达条件，获得较高产量的可溶性重组蛋白，经过镍螯合柱亲和层析后进行分子筛层析，得到高纯度的重组草鱼TNF-??蛋白(rgcTNF-?)和重组草鱼IFN?2蛋白(rgcIFN?2)。利用重组蛋白纯品刺激草鱼头肾白细胞，Real-timePCR分析显示rgcTNF-??能明显诱导NF-?B信号通路中相关因子的mRNA表达水平，且westernblot分析显示rgcTNF-??能调节I?B??磷酸化状态，而rgcIFN?2则能有效促进LPS诱导的IL-1??mRNA表达水平，从而对此两种重组蛋白功能活性进行初步探讨。本课题从分子克隆、序列分析、重组表达、蛋白纯化及活性鉴定等不同层面研究草鱼TNF-?