灌注层析——高等生物分离技术.pptVIP

图 2 双乳介质的合成工艺流程图 * 从上图可以看出，制得的双孔介质的平均粒径是 42.8 μm，体积平均粒径为45.0 μm，主要分布在 30～60 μm 之间。 图 3 BiPB（双孔介质）的粒径分布图 * 两种介质的性能表征 从上图可以看出，MiPB的平均粒径为42.3 μm，体积平均粒径为44.9 μm，与BiPB的平均粒径与体积平均粒径都很相近，说明其粒度分布状态类似。 图 4 MiPB(常规微孔球) 的粒径分布图 * 图 5 :双孔介质的扫描电镜图（ a:1800× b:10000×）从图可以看出在低倍的SEM图上小球的表面呈海绵状，与Perspective Biosystem 公司POROS介质外形相近，说明超孔致孔剂在上面留下的超孔，在高倍的SEM上可以看到超孔与微孔交错存在的现象。 利用 SEM （扫描电镜）观察双孔介质的微观结构，并拍摄照片，结果如图 * 利用 SEM 观察微孔球可以得到如图 图 6 微孔介质的扫描电镜图(a: 2,500×; b: 10,000×) 从上图可以看出微孔球上的微孔的数量很多，从而增加了微孔球的比表面积。 * 对双孔介质与微孔介质利用汞压计进行测定，得到如图7 所示的孔径分布图。 图 7 两种介质的孔径分布图 * 图 8 两类介质的孔体积分布图 * 从图7和8可以看出双孔介质的孔径公布主要是两个范围，一个是 20～100 nm，另一个是 300～4000 nm，而微孔介质的孔径范围是 20～100nm。说明了甘油溶液微滴在介质聚合过程中起到了形成超孔的作用。 * 微孔介质含有大量的孔道，所以能够得到大的吸附容量；而双孔介质中即含有超孔，又含有微孔，所以也具有相对大的吸附容量。 图 9 两类介质的对 BSA 的静态吸附图 * 图 10 流速对背压的影响 * 注：背压即后端的压力。通常是指运动流体在密闭容器中沿其路径流动时，由于受到障碍物或急转弯道的阻碍而被施加的与运动方向相反的压力。 从图10可以看出，微孔介质填充柱的背压随流速增加很快，而且不符合线性关系，说明其粒子内部传质靠扩散作用，传质阻力大。双孔介质的填充柱背压比较低，这是由于色谱介质中含有流动相可以对流流过的孔径为1 μm 的超孔，从而提高了流动相在色谱介质内部的传质速率。 同时可以发现，在 0～3600 cm/h 的流速范围内，呈线性关系，证明在设定的操作范围内，色谱介质没有发生压缩形变。这也表明双孔介质具有较好的机械强度，为在高流速下快速分离蛋白质提供了条件。 * 以灌注POROS为介质的反相色谱填料类似于硅胶基质的反相填料，其特点是可以在碱性条件下分离。血管扩张素异构体ⅰ、ii、iii在通常的酸性条件下（0.1% TFA）无法被完全分离；而在碱性条件下（10 m mol/L Na3PO4）,在POROS R/H 柱上2 min内即得到很好的分离。另外，用POROS R/M 填料能在较短时间内完成含有核糖核酸酶、卵清蛋白等蛋白质标准品混合物的分离。 * 六、灌注层析的应用 R型：反相 M型:粒径为20um * Q型：强阴离子交换 H型：粒径为10um R型：强阳离子交换 在快速条件下（5 mL/min）,在50 mm × 4.6 mm i.d. 的POROS Q/H 的灌注离子交换色谱柱上，5 min即可完全分离牛血清白蛋白（BSA）和铁传递蛋白,而且在强阳离子交换色谱柱上每5 min循环1次，在1 mL柱体积上可在1天内得到5 g血清蛋白质。用阳离子交换柱POROS S(100 mm × 4.6 mm i.d.)，在5 mL/min的流速下，经梯度冲洗，5 min内能分离200 μg脉管活化肠多肽（VIP）。 * * * 用POROS Protein A（醛结合的填料）微型色谱柱（30 mm × 2.1 mm i.d.）纯化杂交细胞培养的上清液中的免疫球蛋白（IgG），IgG在 10 m mol/L 磷酸盐+ 0.15 mol/L NaCl缓冲液中,用0.3 mol/L 乙酸+ 0.3 mol/L MgCl2来洗脱，流速为2 mL/min，进样量为500μL。动态柱容量约为每毫升柱体积含12 mg IgG，这种微型柱在快速分离时的线性范围是1-50 μg，大体积的柱型，可以获得高产量的蛋白质制备量。 七、灌注层析的问题 商品化的 POROS 等流通色谱介质, 存在着成本高、制备工艺复杂、价格昂贵等问题。 新型双孔球形介质因制备方法简单快捷、耗时短、价格低廉而引起人们的广泛关注，但是其研制开发技术还不成熟。 * 谢 谢！ 组会汇报 * 灌注层析 王佳慧 生物化工 201