第三章-毒素快速检测方法.ppt

需要使用剧毒的黄曲霉毒素M1作为标定标准物，对操作人员造成巨大的沾污危险，而且黄曲霉毒素M1标准物质购买十分困难。? 操作过程烦琐、复杂、时间长，劳动强度大。? 仪器设备昂贵、笨重、操作复杂，难以实现现场快速分析。 灵敏度较差，重复性很难得到满意结果。 特点 薄层层析法（TLC） 原理:样品经提取、浓缩、薄层分离后，在365 nm波长的紫外光照射下,黄曲霉毒素B1、B2产生紫色荧光,G1、G2产生绿色荧光。 特点：灵敏度低，定量困难。 高效液相（HPLC）法 主要用荧光检测器检测，在适宜的流动相条件下，采用反相C18柱作为固定相，使多种毒素同时得到分离。 原理:以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。 高效液相（HPLC）法 抗原：进入动物体内能刺激动物的免疫系统发生免疫应答，从而引起动物产生抗体或形成致敏淋巴细胞，并能和抗体或致敏淋巴细胞发生特异性反应的物质。 抗体：抗原刺激动物免疫系统，由免疫系统产生分泌的能和相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。 免疫学技术基本概念 金标试纸法 胶体金，也称金溶胶，是金盐被还原成原子金后形成的金颗粒悬液。 胶体金 胶体金颗粒对蛋白质有很强的吸附功能，而不被坏其生物活性，可以与蛋白质等（葡萄球菌A蛋白、免疫球蛋白）等非共价结合，形成胶体金标记物。 衬板 样品垫 金标垫 吸收垫 膜 胶体金免疫层析试纸条的构成 夹心法反应原理 C 阴性 B 阳性 GICA有三种反应模式：夹心法，间接法，竞争抑制法。 金标试纸法 金标试纸法是利用单克隆抗体而设计的固相免疫分析法,可一步式检测AFT。对黄曲霉毒素定性检测准确度在85 %以上,灵敏度为4ng/mL。 定义：用酶标记抗原或抗体检测液体中未知抗体或抗原的方法。 酶联免疫吸附法(ELISA) 酶联免疫吸附法 原理： 利用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接。 通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。 测定的对象可以是抗原也可以是抗体。 1、将已知抗体吸附于载体上 2、温育后清洗 3、加入可能含特异性抗原的待检液和酶标记的已知抗原液 4、温育后清洗 5、加入酶作用底物 6、测定颜色反应深浅(分别测定两管的吸光度值，计算标本中待测抗原含量) 酶联免疫吸附-竞争法 固相抗体 E E E 酶标抗原待测抗原 E 底物 E 显色反应（弱） 固相抗体 E E E 酶标抗原 底物 显色反应（强） E E E E E E 双抗体夹心法 基本工作原理：利用连接于固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个抗原决定簇结合，形成固相抗原-抗体-酶标抗体免疫复合物。 获得待分析物的未标定抗体 将特异性抗体与固相 载体连接形成固相抗体 洗涤除去未结合的 抗体及杂质 加入封闭蛋白溶液以封闭载体 表面残留的蛋白结合位点 洗涤并除去未结合的封闭蛋白 加受检标本（抗原）形成 固相抗体－抗原复合物 洗涤除去其他 未结合的物质 加酶标抗体生成 抗体—待测抗原—酶标记抗体 的复合物 彻底洗涤 未结合的 酶标抗体 加底物进行 酶催化反应 根据颜色反应的 程度进行该抗原 的定性或定量测定 免疫亲和柱法-最新国标法 该法可以采用配套的荧光仪进行检测，也可以和高效液相色谱法结合，解决标准物污染和操作过程繁复等问题。 免疫亲和柱法 该种方法有着较好的权威性和通用性，且为国外多个组织认可，被列为标准方法，如：??? 美国公职分析化学家协会（AOAC）??? 美国农业部联邦谷物检测中心（FGIS）、国际纯粹与应用化学协会（IUPAC）、美国食品药品行政署（US-FDA）、美国农业部（USDA）??? 在国内被认证的机构：中国出入境检验检疫局（CIQ）、中华人民共和国国家标准（GB） 免疫亲和柱法 认证机构广泛，通用性强。? 分析速度快，一个样品只需10－15分钟。 灵敏度高，测定范围广泛（0－300ppb）,用荧光计可以测定0.1ppb的黄曲霉毒素M1，用HPLC可以检测出10ppt的黄曲霉毒素M1。? 采用单克隆免疫技术，分离效率和回收率高，正确性和可靠性强。? 仪器轻便容易携带，自动化程度高，操作简单，直接读出测试结果，对实验操作人员要求不高，可以在小型实验场所使用。? 不需要标准物来标定，绝对安全可靠。 原理 利用抗原与抗体的高亲和力、高专一性和可结合的特点以及色谱技术的差速迁移理论而建立的一种新型色谱技术。 就是将被测物的特异性抗体固定在适当的固相载体上，制备成免疫亲和色谱的固定相（免疫亲和色谱柱），根据被测物的反应原性、抗原抗体结合的特异性记忆，抗