串珠镰刀菌致小鼠局部皮肤感染实验分析-experimental analysis of local skin infection caused by fusarium moniliforme in mice.docx

山西医科大学硕士学位论文山西医科大学硕士学位论文 PAGE PAGE 1前 言近年来,机会性真菌感染的菌谱发生了一些变化，一组名为“新出现真菌”引起的感染 日益受到重视，如镰刀菌属 [1]。镰刀菌指在常规HE染色上看不清或表现为透明的、有分隔、 分支或不分支, 偶呈念珠样, 而细胞壁不呈暗色的条件致病菌(除外曲霉)进入组织所引起 的感染。用PAS或银染色则可以清楚地染出红色或黑色菌丝[2]。镰刀菌属，广泛存在于土壤、 植物、空气中。镰刀菌属属于半知菌亚门、丝孢菌纲、丝孢菌目、瘤痤孢科。常见的病原菌有串珠镰 刀菌，茄病镰刀菌，尖孢镰刀菌，雪腐镰刀菌，梨孢镰刀菌，本色镰刀菌，半裸镰刀菌， 禾谷镰刀菌，燕麦镰刀菌等[3]。其中串珠镰刀菌是最为常见的引起人类感染的镰刀菌。自国内1963年首次报告镰刀菌致病及国外1973年首次报告茄病镰刀菌引起的播散性感 染以来, 镰刀菌引起了人类感染, 尤其是在免疫缺陷病人中逐年增多, 其发病率和病死率 仅次于白色念珠菌和曲霉菌感染。常见的致病镰刀菌有茄病镰刀菌、串珠镰刀菌和尖孢镰 刀菌等, 但目前至少还有12种镰刀菌与人类感染有关。镰刀菌感染在人类以局部多见, 最 常见的为角膜真菌病、足菌肿等[4]。也有引起坏疽性脓皮病、趾间糜烂、小腿溃疡等报道[5, 6]。镰刀菌感染的临床表现多种多样[7],有角膜炎症和溃疡[8] 、真菌血症[9,10, 11] 、腹膜炎[12] 、 皮肤溃疡[ 13, 14] 、坏疽性脓皮病[ 15] 等, 文献曾相继报道由茄病镰刀菌引起的下肢皮肤肉芽 肿溃疡[16]和由尖孢镰刀菌所致的播散性透明丝状霉菌病[17],治疗效果差, 甚至死亡。近年发 现在免疫缺陷者中的发病率和死亡率仅次于白念珠菌和曲霉感染, 国际上已将镰刀菌病列 为重要的感染性疾病(emerging infectious disease)[18] 。镰刀菌(Fusarium)是常见的土壤微生物和重要的植物致病真菌,危害农作物造成严重减 产。一定条件下也可引起多种人类疾病，主要包括真菌毒素性疾病和局部或播散性感染（两 个以上不相邻器官受累称为播散性感染）,但一般情况下并不致病, 镰刀菌感染局部引起的 疾病包括皮肤感染、甲真菌病、角膜炎、眼内炎、鼻窦炎、腹膜炎、骨髓炎等。有些还与 克山病、大骨节病和食管癌有关。由于镰刀菌感染多数引起皮肤损害，同时皮肤组织易获 得性，目前皮肤组织病理和组织真菌培养已成为诊断镰刀菌病的一种比较方便可行的办法， 以便帮助临床医生做出早期诊断治疗。近些年来各型白血病、器官移植、造血干细胞移植等患者的增多，以及免疫抑制剂、 糖皮质激素、化疗药物等大量应用，严重免疫抑制人群中镰刀菌的播散性感染已成为仅次 于曲霉菌的第二大致病丝状真菌，死亡率很高，正逐步受到世界各国医学工作者的高度重 视。且国内外文献关于人镰刀菌感染的报道大多集中在眼部感染、鼻窦感染、肺部感染等方面。也有茄病镰刀菌引起的皮肤和皮下组织感染的报道[19]，而串珠镰刀菌致病的报道仅有散在的病例报告[20]，关于串珠镰刀菌致病的动物实验研究未见报道。目前，串珠镰刀菌致病的皮损特点还不清楚，为了了解串珠镰刀菌致病的皮损特点， 本研究设计了不同浓度和不同免疫状态下串珠镰刀菌致小鼠局部皮肤感染实验研究。材料与方法一、实验材料1.1 动物选择清洁级 BALB/c 小白鼠, 72 只,鼠龄 6～8 周,体重 18～23g,雄性,来自山西医科大 学实验动物中心。1.2 菌株来源串珠镰刀菌临床分离菌株来自山西医科大学第一医院皮肤科住院病人，已由北京大学 真菌与真菌病鉴定中心鉴定为串珠镰刀菌。1.3 主要试剂和仪器1.3.1 主要试剂：琼脂 北京化学试剂公司葡萄糖 北京化学试剂公司吐温 20 北京化学试剂公司注射用环磷酰胺 江苏恒瑞医药股份有限公司主要仪器液体快速混合器 江西医疗器械厂光学显微镜 日本奥林帕斯公司天平 天津市天平仪器有限公司一次性塑料平皿 姜堰市新康医疗器械有限公司微波炉 顺德格兰仕电器厂马铃薯琼脂培养基（Potato Dextrose Agar,PDA）的制备试管 PDA 培养基制备：先将马铃薯洗净去皮切成片状，称取 200.0g，加水 180ml，放 入微波炉煮沸 30min 后纱布过滤至 1000ml 锥形瓶中，再加入葡萄糖 20g，然后加入琼脂 15g， 氯霉素 200mg，滤液补足至 1000ml，微波炉加热充分溶解后，趁热分装试管约 5ml，高温 121℃,15min 灭菌后取出试管摆斜面，冷却后贮存备用。平皿 PDA 培养基制备：过程试管 PDA 培养基制备基本相同，1000ml 上述液体高温 121℃,15min 灭菌后，无菌操作台趁热分装直径 9.0cm 平皿约 15ml，冷却后贮存备用[1]。1.3