第二十章 基因治疗的研究.docVIP

第二十章 基因治疗研究基因治疗（gene therapy）概念： 将目的基因导入靶细胞内，成为宿主细胞遗传物质的一部分，目的基因表达产物对疾病起治疗作用。目的基因是多样的，可以是正常用基因、抑制基因、自杀基因、特定基因，不同的基因治疗策略是以不同的形式利用基因产生治疗效应，使用于不同的疾病的治疗。针对不同疾病可以采用不同的基因治疗策略一.基因置换（gene replacement）可以矫正缺陷基因指通过同源重组或基因打靶技术，将正常基因定点整合到靶细胞基因组内,以原位替换致病基因。不涉及基因组整体改变的情况下对缺陷基因进行精确的原位修复，是最理想的治疗方式。二.基因添加（gene augmentation）使细胞表达原来不能表达的蛋白又称基因增补（gene augmentation）,为补偿性基因治疗 两种基因类型：1.是指不去除异常基因，将有功能的正常基因导入病变细胞或其它细胞后发生非定点整合，表达正常产物以补偿缺陷基因的功能，或使原有的功能得以加强。2.导入靶细胞本身不表达的基因，利用其表达产物达到治疗目的。三.基因干预（gene interference）是抑制特定基因的表达采用特定方式抑制某个基因的表达，或者破坏某个基因的结构而使之不能表达，达到治疗目的。此类靶基因往往是过度表达的癌基因或病毒基因。四.导入自杀基因（suicide gene）可产生细胞自杀效应导入基因诱导细胞自杀效应。其原理是这种自杀基因在宿主细胞内编码的酶能使无毒性的药物前体转化为细胞毒性代谢物，诱导靶细胞产生“自杀”效应，从而清除肿瘤细胞。五.基因修饰（）能够改变细胞的功能特性属于基因添加，但侧重导入外源基因而使某些细胞具有新的生物学特性，并利用这些新特性达到治疗目的。第二节 基因转移技术主要有生物学法和非生物学法两大类基因转移途径：经活体（ex vivo）靶细胞在体外导入外源基因集体外增殖、筛选、药物处理后回数患者体内；经典、安全、治疗效果易控制，但操作复杂、不易推广；活体内（in vivo）将无复制能力含外源基因的重组病毒直接应用于患者体内。操作简便、易推广，但方法尚不成熟、未能解决疗效短、免疫和安全问题。一.基因转移的生物学方法是以病毒载体作为基因转移系统逆转录病毒基因组经过改造后作为基因载体逆转录病毒基因组经过改造后作为基因载体构建:逆转录病毒(retrovirus) XE 逆转录病毒(retrovirus) 属RNA病毒，通过其本身逆转录酶的作用，形成双链DNA原病毒,然后整合于宿主细胞染色体中, 详细的基因结构及生活史见第十三章。构建载体时以DNA原病毒为基础，将野生型病毒的3类结构基因gag，pol和env删除，以供外源基因的插入，但是要保存病毒的包装序列（ψ）和双侧的长末端重复（LTR），LTR含有启动子、增强子、整合信号及poly A信号等多种元件。插入的基因一般为两种或两种以上，一种为标记基因（marker gene） XE 标记基因（marker gene） 供阳性筛选，常用的为原核细胞的新霉素磷酸转移酶Ⅱ（NPT Ⅱ,neoR基因），该酶能破坏抗生素G418（新霉素的衍生物）的活性。哺乳动物细胞在含G418的培养液中不能生长，若含有neoR基因能产生NPT Ⅱ，即能在含有G418的培养液中生长，故便于筛选转导基因的细胞。另一种为供治疗用的基因，治疗基因和标记基因可识别受控于不同启动子，其中一种受逆转录病毒的LTR调控，另一种常需连接另外的启动子序列，或者连接一种称为内核糖体进入位点序列（IRES），使转录成一条多顺反子mRNA，在翻译过程中IRES具有内启动作用，能启动蛋白质的合成，所以同一分子mRNA能合成2种或2种以上不同的蛋白质。如何包装成含有外源基因的逆转录病毒供治疗用的呢？因为载体本身的3类结构基因已被删除，因此包装所需的结构蛋白质，需要靠一种所谓的包装细胞，如PA317, 提供，这种细胞含有一种缺失包装信号的逆转录病毒，只能产生包装所需的结构蛋白质，但本身的病毒RNA因缺失包装信号,所以不会被包装成病毒颗粒，这对治疗的安全性很重要，可避免产生有复制潜能的逆转录病毒（RCR）。将上述所构建的载体转染包装细胞PA317，可产生供治疗用的含有治疗基因的逆转录病毒颗粒，见图21-8，这种病毒能高效感染细胞，使治疗基因能够整合至细胞的染色体中，从而能长期表达基因产物，以达到治疗目的。优缺点:最大的优点为能准确整合于宿主细胞的染色体中，所携带的外源目的基因及有关序列不会发生重排，因而能长期稳定表达。感染细胞范围较广，感染率比较高，由于结构基因均被删除，因此免疫原性较低。对感染细胞无毒性作用。可附加不同的调控元件来提高外源基因的表达效率，并对之进行调控。局限性：逆转录病毒只能在核膜尚未形成时，才能进入核内，因此它只能将外源