实验二 白细胞的吞噬及溶菌酶试验.docxVIP

医学免疫学实验指导实验二 白细胞的吞噬及溶菌酶试验用由长沙达尔锋生物科技有限公司整理【文章介绍】实验是映证理论，对学生进行基本技能训练和培养科学研究能力的手段。BioRike博瑞克系统的介绍了14个实验项目，每个实验说明实验目的，实验原理，实验内容方法，实验要求及注意事项，希望广大师生能够从中有所收获。?BioRike简介：BioRike（中文简称“博瑞克”）是长沙达尔锋生物科技有限公司旗下的产品品牌,由旗下专业的生命科学实验室BioRike博瑞克研发和生产。BioRike是一家致力于生命科学和生物技术领域的高科技实验室，专门从事以 HYPERLINK / \t _blank Elisa试剂盒、抗体、细胞因子、免疫检测试剂盒等免疫学产品为主的生物试剂的研发与销售。【实验目的】1.熟悉白细胞的吞噬及溶菌酶试验的原理和方法。2.通过本实验理解机体的非特异性免疫机制。【实验原理】机体内具有吞噬功能的细胞大致分为两大类，即小吞噬细胞和大吞噬细胞。小吞噬细胞一般指血液中的中性粒细胞，大吞噬细胞则是存在于组织中的巨噬细胞和血液中的大单核细胞。它们构成机体天然防御机能。本实验通过体外或动物体内的细胞吞噬及溶菌酶试验，以证实机体的非特异性免疫机制。【实验用品】1.器材：显微镜、载玻片、厚凹玻片、接种环、采血针、滴管、湿盒、恒温培养箱、注射器、针头、打孔器、平皿、酒精灯、火柴。2.材料、试剂：3.8％枸橼酸钠、2％碘酒、75％酒精、瑞氏染液、蒸馏水、6％可溶性淀粉、1％鸡红细胞悬液、溶壁微球菌(100mg／m1)、l／15mol／L磷酸盐缓冲液(pH6.4)、琼脂、标准溶菌酶(100ug／m1)、新鲜鸡蛋清(1:10)、生理盐水、香柏油。3.菌种：白色葡萄球菌24小时斜面培养物。4.动物：小白鼠 【内容和方法】 一、小吞噬试验(中性粒细胞吞噬功能试验) 1.方法 (1)取厚凹玻片一片，在凹孔中用滴管加入一滴3.8％枸橼酸钠溶液。 (2)依次用碘酒、酒精消毒手指或耳垂及采血针后，从消毒部位采取三大滴血加入凹孔中混匀。 (3)将接种环烧灼灭菌后，刮取少许白色葡萄球菌置于凹孔血液中搅匀。 (4)将上述凹玻片放人湿盒，于37℃温箱中作用45分钟，注意每15 (5)取出凹玻片，用烧灼灭菌的接种环将凹孔中血液搅匀后取血3—4环于载玻片上，用另一载玻片推成薄血片。接种环烧灼灭菌后放回原处。 (6)待血片自干后，用瑞氏染液染色。用吸管取瑞氏染液数滴滴于上述血片上先染1分钟。然后加等量缓冲液，轻轻晃动混匀，继续染5分钟后水洗，用吸水纸吸干后镜检。 2.结果分析 油镜检查，先寻找白血球，观察胞浆中有无吞噬的细菌。如结果正确可见染成紫色的细胞核及被吞噬的细菌，细胞桨则为淡红色。 随机计数100个中性白细胞，记录发生吞噬和未发生吞噬的白细胞数，计数吞噬细胞百分率。 二、大吞噬试验 1.试剂配制 (1)6％可溶性淀粉肉汤：取肉汤培养基100ml，加入可溶性淀粉6g，混匀后煮沸灭菌，冷却后置4℃冰箱保存(只能保存一周)。使用时37 (2)1％鸡红细胞悬液：取肝素抗凝鸡血1m1，加生理盐水99ml混合。 2.方法 (1)试验前3天，于小白鼠腹腔内注射6％可溶性淀粉肉汤lml(注射时切勿刺伤内脏)。 (2)试验当天，于每只小白鼠腹腔内注射1％鸡红细胞悬液lml并轻揉腹部。 (3)注射后30分钟，用注射器吸取腹腔液少许，置于洁净载玻片上，推成涂片、晾干。用瑞氏染液染色。 (4)油镜观察小白鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞现象(鸡红细胞为有核红细胞)，并计算吞噬细胞的百分率。 瑞(Wright)氏染液：瑞氏染粉0.1g，甲醇60ml，先将染粉置研钵内加少量甲醇研磨，然后加入全部甲醇。配好的染液要装瓶塞紧，置二周后使用。 三、溶菌酶测定 1.试剂配制 (1)溶壁微球菌菌液的制备：菌种于使用前先在琼脂斜面上传代一次，然后接种于琼脂斜面培养基中，37℃培养24小时后收集菌苔，称重、用pH6.4磷酸盐缓冲液配成100mg／ml菌液。经70℃水浴l小时杀菌，放置(2)pH6.4 1／15mol/L磷酸盐缓冲液(沙伦生PBS)：甲液：无水Na2HPO49．46g溶于1000ml蒸馏水。乙液：无水KH2PO4 9．078g溶于1000ml蒸馏水。然后取甲液27ml，乙液73ml，加NaCl 0.5g即成。2.方法及结果 (1)将1％磷酸盐缓冲液琼脂100rnl加热溶化，待冷至50—60℃时加入微球菌菌液1m1(每m1琼脂内含标准溶壁微球菌1mg)混和均匀，注入无菌平皿，每个平皿15ml (2)琼脂凝固后，用打孔器在琼脂板上打4