白桦脂酸对质粒急性感染模型小鼠HBV DNA抑制作用研究.docVIP

白桦脂酸对质粒急性感染模型小鼠HBV DNA抑制作用研究 　　[摘要]桦木酸是一种天然存在的五环三萜系化合物，它具有抗逆转录病毒，抗疟疾和抗炎特性。该研究主要目的是观察白桦脂酸对Payw1.3质粒急性感染小鼠模型的HBV DNA复制的抑制作用。实验的Payw1.3质粒急性感染小鼠模型（n=15）采用水动力转染技术构建，随机分为PBS对照组（n=5），白桦脂酸药物治疗组（n=5）及拉米夫定对照组（n=5），建模成功后次日分别予以白桦脂酸（100 mg?kg-1），拉米夫定（50 mg?kg-1），PBS药物灌胃，每日1次，连续7 d，分别在3，5，7 d眼眶静脉后采血，ELISA法测血清中HBsAg及HBeAg表达，并在7 d后处死小鼠，southern法检测肝组织HBV DNA表达。结果发现与PBS对照组相比，5 d时白桦脂酸能明显抑制Payw1.3质粒急性感染小鼠HBsAg表达（P　　[关键词]白桦脂酸；乙型病毒性肝炎；动物模型；水动力转染技术 　　我国是乙肝大国，感染HBV的人数众多，据统计我国现有乙肝病人超过3 000万人，每年因肝病死亡人数约为30万人，因此对于乙肝的治疗一直是国家的重点科研项目。治疗乙肝的药物层出不穷，现阶段主要抑制HBV复制的西药有干扰素及核苷类似物如拉米夫定，阿德福伟，恩替卡韦等，但各有利弊如病毒易于变异，毒副作用大，且价格昂贵，长期治疗并不经济划算等。由于中医药治疗肝病有其良好的治疗效果，且价格便宜，毒副作用小，因此是近期国内外研究的重点。三萜类物质是一类重要的次生代谢物质，具有抗癌抗肿瘤、免疫调节、保肝、抗氧化、消炎镇痛、抑菌抗病毒及防治心脑血管疾病等药理活性[1]，具有广阔的开发研究前景。白桦脂酸，又名桦木酸，是五环三萜类化合物，英文名称为betulinic acid（BA），有数种植物类来源，其中以桦木科桦木属桦树的外皮中含量最多[2]。 　　国内外对白桦脂酸及其衍生物的研究主要集中在抗肿瘤及抗病毒的作用研究上[3-8]，并且也已经有有关新药用于临床Ⅱ期研究[9-12]。笔者前期的研究发现，白桦酯酸能够明显下调2215细胞上清液中HBsAg和HBeAg水平，有明显的抗HBV作用。因此笔者复制HBV急性感染小鼠模型，用于观察药物对于抗HBV体内机制的研究。 　　1 材料 　　C57b/l小鼠，雄性，体重18～22 g，由上海中医药大学实验动物中心提供。动物自由进食、饮水、喂养标准颗粒饲料，室温18～22 ℃，相对湿度40%～60%。常规饲养观察1周后使用。 　　白桦脂酸（质量分数98%，上海鼎瑞化工有限公司）；Payw1.3质粒（中科院上海巴斯德病毒研究所）；乙肝病毒表面抗原诊断试剂盒酶联免疫法（上海科华公司）；乙肝病毒e抗原诊断试剂盒酶联免疫法（上海科华公司）；拉米夫定LAM（葛兰素史克制药有限公司）；无水乙醇、甲醇、氯化钠、氯化钾、十二水合磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯仿、异丙醇、SSC（上海国药）；DiG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit Ⅱ（美国Roche公司）。 　　小型台式离心机（Sigma）；水平转头离心机（Sigma）；电子分析天平（Sartorius）；低温高速离心机（Sigma 3K 30）；-70 ℃超低温冰箱（SANYO）；酶标仪（美国bio-tek）；琼脂糖凝胶电泳装置（北京六一仪器厂）；凝胶成像分析系统（Alpha Image 3400）；细胞培养用CO2孵箱（Hereaus Cell）；聚丙烯酰胺凝胶电泳装置（Bio-Rad）；水浴箱（上海）。 　　2 方法 　　2.1 药物配制 白桦脂酸：精密称取BA粉末，用无菌PBS配成100 mg?kg-1的混悬液。拉米夫定：精密称取LAM粉末，用无菌PBS配成50 mg?kg-1的药液。Payw1.3质粒：将16 μg Payw1.3质粒溶于1.5 mL无菌PBS中。 　　2.2 分组 将实验小鼠随机分为3组，PBS对照组（PBS），白桦脂酸药物（BA）治疗组及拉米夫定（LAM）对照组，每组5只。将Payw1.3质粒16 mg?1.5 L-1经尾静脉快速（[13]。次日开始分别灌胃白桦脂酸（100 mg?kg-1），LAM（50 mg?kg-1）及等容量的PBS进行对照。模型建立后分别在3，5，7 d眼眶静脉后采血。 　　2.3 ELISA法测血清HBsAg及HBeAg表达 按照乙肝病毒表面抗原诊断试剂盒（酶联免疫法）及乙肝病毒e抗原诊断试剂盒（酶联免疫法）（上海科华公司）步骤。 　　2.4 Southern法检测肝组织HBVDNA的表达 取200 mg肝组织提取DNA，方法按照文献[14]。样品经HindⅢ37 ℃酶切1 h，用1%（质量分数）琼脂糖凝胶电