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汉黄芩素抑制乳腺癌细胞增殖及侵袭实验研究 　　[摘要] 目的：研究汉黄芩素对乳腺癌细胞MDA-MB-231生长和增殖的影响，同时观察汉黄芩素对MDA-MB-231细胞黏附、迁移和侵袭能力的影响，进一步探讨其分子作用机制。方法：MTT法检测汉黄芩素对MDA-MB-231细胞生长的影响；Ki-67法检测汉黄芩素对细胞增殖的影响；划痕实验、黏附试验和侵袭小室法检测对MDA-MB-231细胞迁移和侵袭能力的影响；Western blotting检测对增殖和转移相关蛋白及相关信号通路的影响。结果：汉黄芩素能明显抑制MDA-MB-231细胞生长和增殖；低浓度情况下明显抑制乳腺癌细胞的迁移、黏附和侵袭能力；汉黄芩素有效抑制MDA-MB-231细胞Survivin，Bcl-2，ICAM-1，MMP-2，MMP-9蛋白的表达。结论：汉黄芩素明显抑制乳腺癌细胞生长和增殖，并抑制MDA-MB-231细胞迁移、黏附、侵袭，其对MDA-MB-231细胞的侵袭和黏附影响可能与其降低ICAM-1，MMP-2，MMP-9表达有关。 　　[关键词] 汉黄芩素；凋亡；迁移；侵袭 　　[收稿日期] 2013-09-06 　　[基金项目] 福建省自然科学基金项目（2012D047）；厦门市科技项目（3502 　　[通信作者] 黄恺飞，博士，E-mail： hkf5306@163.com；刁勇，博士生导师，E-mail： diaoyong@ 　　汉黄芩素是植物黄芩的主要活性成分之一，是一种黄酮类化合物，主要存在于植物的根和茎中。汉黄芩素具有广泛的生物活性，如抗肿瘤、抗氧化、抗炎、神经保护和抗病毒等[1]，尤其在抗肿瘤活性方面，成为国内外研究的一个热点。 目前研究表明，汉黄芩素对多种肿瘤细胞都具有抑制作用，其机制主要包括：上调p53，Bax/Bcl-2的比值，下调Survivin诱导细胞凋亡[2-4]；抑制核因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）信号通路[5]，阻滞细胞周期由G1期向G2期过渡[6]；下调血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），同时抑制血管内皮生长因子受体-2（vascular endothelial growth factor receptor-2，VEGFR-2）的磷酸化，从而抑制肿瘤血管生成等[7-8]。本课题组同样发现汉黄芩素对肺癌、乳腺癌具有良好的抑制作用[4，9]。虽然汉黄芩素的抗肿瘤活性成为众多研究人员关注的热点，但是其研究广度与深度尚不足，其确切机制尚不清楚。本研究观察了汉黄芩素对乳腺癌MDA-MB-231细胞生长、增殖、迁移、侵袭的影响，为汉黄芩素在抗乳腺癌的临床应用及其作用机制的深入研究提供实验基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 细胞株、试剂和仪器 乳腺癌MDA-MB-231细胞由本实验室保存并提供。兔抗人细胞间黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1），MMP-9，MMP-2，Survivin，Bcl-2多克隆抗体和辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG多克隆抗体均为武汉博士德生物工程有限公司产品；Ki-67检测试剂盒购自南京凯基生物公司；汉黄芩素（wogonin）购自Sigma公司（纯度98%）。RPMI 1640 培养液干粉和小牛血清为Gibco公司产品；化学发光试剂盒、蛋白定量试剂盒、纤黏连蛋白（fibrinectin，FN）和层黏连蛋白（laminin，LM） 为Sigma公司产品；Thincert侵袭小室为Greiner公司产品。酶标仪为美国MD公司产品；倒置相差显微镜为Nikon公司产品；垂直电泳槽凝胶和成像仪及分析系统均为Bio-Rad 公司产品。 　　1.2 MTT 法检测汉黄芩素对MDA-MB-231细胞活力的影响 MDA-MB-231 细胞培养于含10%胎牛血清1640培养基中，将对数生长期的肿瘤细胞消化、计数，9×103个/孔铺于96孔板，过夜后加入以1640培养液配制的汉黄芩素至终浓度分别为10，20，40，80，160，320 μmol·L-1，对照组仅加入相应体积的培养液，每一浓度设6个平行孔，继续培养44 h，弃上清，每孔加入无血清1640培养液溶解的MTT（50 mg/孔），37 ℃，5%CO2细胞培养箱孵育4 h，弃上清，以DMSO溶解蓝紫色颗粒，于酶标仪570 nm处测吸光度，再计算细胞抑制率。 　　1.3 Ki-67流式细胞仪检测法观察对细胞增殖的影响 采用爬片法收集细胞，即将细胞接种于孔底放置了洁净盖玻片的6孔培养板中，每孔含1×105个细胞，置37 ℃，5%CO2饱和湿度的细胞培养箱内培养。待细胞贴壁后加入汉黄芩素，分别为50，