黄芪多糖口服吸收促进剂研究.docVIP

黄芪多糖口服吸收促进剂研究 　　[摘要] 该实验利用黄芪多糖中引入的仲氨基与FITC中氰基发生亲核反应，得到FITC荧光标记的黄芪多糖，并采用Caco-2细胞模型评价了低相对分子质量壳聚糖和鱼精蛋白对黄芪多糖的吸收促进作用。结果表明该荧光标记方法稳定性好，灵敏度高；低相对分子质量壳聚糖和鱼精蛋白对细胞毒性作用均较小；2种吸收促进剂对黄芪多糖的吸收均具有一定的促进作用，同时吸收促进剂的比例越大时，作用越明显，低相对分子质量壳聚糖的作用略强于鱼精蛋白。实验前后细胞跨膜电阻（TEER）的变化表明其作用机制可能是吸收促进剂能暂时打开细胞间的紧密连接，增加了膜的流动性，从而提高药物的透过性。 　　[关键词] 黄芪多糖；FITC；Caco-2细胞模型；吸收促进剂 　　黄芪多糖（Astragalus polysaccharides，APS）是中药黄芪的主要生物活性成分，其药理作用十分广泛，具有增强机体免疫功能、强心、抗病毒、抗肿瘤、调节血压、抗衰老、抗氧化延缓衰老等作用[1-4]。黄芪多糖主要是由葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖和半乳糖等重复单元连接而成，属于水溶性物质[5]，其中相对分子质量在10 000～50 000的活性最强，由于黄芪多糖属于生物大分子，且亲水性强，因而其生物透膜性差，口服生物利用度较低[6-7]。 　　采用吸收促进剂提高药物的生物利用度是常用且有效的手段，吸收促进剂的种类繁多，但大多数吸收促进剂的作用与其细胞毒性高度相关，不能应用于肠道[8]。本实验选择了2种低毒而有效的吸收促进剂壳聚糖（CS）和鱼精蛋白（PS），研究其对黄芪多糖的吸收促进作用。Caco-2细胞模型是被国内外广泛应用并被认可的体外吸收模型。由于在吸收过程研究中比较简单、重复性好，目前正被广泛应用于评估药物的细胞渗透性、阐明药物转运的途径等研究中[9-11]。本实验采用Caco-2细胞模型研究2种吸收促进剂对黄芪多糖的吸收促进作用，从而为黄芪多糖的口服制剂的研究和发展提供实验基础。 　　1材料 　　二氧化碳培养箱（美国Nuaire公司）；XDS-1B倒置显微镜（重庆）；Millicell-ERS跨膜电阻仪，Milli-Q纯水机（美国Millipore公司）；Transwell 培养板（丹麦NUNC公司）；高速冷冻离心机（美国Beckman公司）；F96S荧光分光光度计（上海棱光技术有限公司）。 　　Caco-2 细胞由美国胡明博士馈赠；DMEM 培养基（美国 Hyclone公司）；胎牛血清（美国 Equitech-Bio公司）；非必需氨基酸（美国JRH公司）；异硫氰酸荧光素（FITC），谷氨酰胺，胰蛋白酶，酪胺（美国Sigma公司）；硼氢化钠（国药集团化学试剂有限公司）；Hank′s缓冲盐溶液（HBSS ）和磷酸盐缓冲溶液（PBS）均自配；黄芪多糖（实验室自制，纯度92.3%）；壳聚糖（CS，相对分子质量30 000，浙江金壳生物化学有限公司）；鱼精蛋白（PS，德瑞生物科技有限公司）；水为超纯水，其他试剂均为分析纯。 　　2方法与结果 　　2.1黄芪多糖的荧光标记 　　2.1.1APS-Tyr的合成 取APS 200 mg溶于20 mL 0.2 mol·L-1的磷酸钾缓冲液（pH 8.0），加入酪胺（Tyr）200 mg，室温下反应24 h。然后加入硼氰化钠100 mg，于37 ℃水浴中反应96 h，间或振荡，反应完毕后。离心分离，将其上清液上Sephadex G-25柱。用水洗脱，在280 nm下检测收集的第一峰。冻干后得多糖和酪胺的合成产物APS-Tyr。 　　经Sephadex G-25分子筛色谱柱分离，在280 nm 波长处检测各管样品的吸光度，见图1，APS在280 nm 波长处无特征吸收峰存在，而Tyr在280 nm 波长处有特征吸收峰，同时第1个峰用苯酚硫酸法测得有糖存在，而第2个峰无糖存在，初步证明第1个峰既有APS又有Tyr存在，而第2个峰只含有Tyr，说明合成的APS-Tyr 首先出峰，未与SEP 结合的酪胺在其后出峰，APS-Tyr得到纯化。 　　2.1.2APS-Tyr-FITC的合成[12-13] 取APS-Tyr 200 mg溶于适量水中，用0.5 mol·L-1 NaHCO3调pH至8.5，然后加入FITC 20 mg，于室温下避光反应过夜，向反应物中加入适量无水乙醇至乙醇终浓度为80%，有大量亮黄绿色沉淀析出，离心，弃去上清液，沉淀加水复溶，乙醇再沉淀，按照此操作重复3次，最后一次沉淀用少量水溶解，进一步上 Sephadex G-25柱纯化，收集相应水洗脱的组分，冻干保存得APS-Tyr-FITC。经FITC标记的APS-Tyr-FITC为橙红色粉末，其水溶液呈明显的黄绿色荧光。 　　经Sephadex G-25分子筛色谱柱分