细胞融合-生物学试验教学中心.PPT

人工诱导的细胞融合，在六十年代作为一门新兴技术而发展起来。由于它不仅能产生同种细胞融合，也能产生种间细胞的融合，因此细胞融合技术目前被广泛应用于细胞生物学和医学研究的各个领域。这一技术已成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育的重要手段。 1.正常小鼠脾脏中含有不同的B淋巴细胞 2.一个B淋巴细胞只能分泌一种特异性的抗体 3.在体外培养条件下，B淋巴细胞不能无限增殖 4.小鼠的骨髓瘤细胞可以无限增殖，但不能分泌抗体 单克隆抗体的制备 『目的要求』 1、了解细胞融合的原理。 2、掌握细胞融合的实验方法 『实验用品』 血球计数板、水浴锅、离心机、光学显微镜、载玻片、50%PEG溶液、GKN液、生理盐水、鸡血红细胞（有细胞核） 『实验原理』 在通常情况下，两个细胞接触并不发生融合现象，因为各自存在完整的细胞膜。在某些诱导物（如仙台病毒、聚乙二醇等）的诱导下，使亲本细胞膜发生一定的变化，能使两个或多个或更多的细胞融合。细胞融合过程，首先是在诱导物的作用下出现细胞凝集现象。然后，在细胞粘连处发生融合，而成为多核细胞。最后，经有丝分裂，细胞核进行融合，遂形成新的杂种细胞。 细胞融合过程两个细胞的细胞膜从接触、重排到形成细胞桥的过程示意图 诱导细胞融合的主要方法有： 1. 病毒诱导融合：有许多种类的病毒能介导细胞融合，最常用的是灭活的仙台病毒（HVJ），为RNA病毒。病毒诱导细胞融合的过程有：首先是细胞表面吸附许多病毒粒子，接着细胞发生凝集，几分钟至几十分钟后，病毒粒子从细胞表面消失，而就在这个部位邻接的细胞的细胞膜融合，胞浆相互交流，最后形成融合细胞。 2. 化学融合剂诱导融合：化学融合剂主要有高级脂肪酸衍生物、脂质体、钙离子、水溶性高分子化合物、水溶性蛋白质和多肽，其中最常用的是聚乙二醇（PEG）。PEG用于细胞融合至少有两方面的作用：①可促使细胞凝结；②破坏互相接触处的细胞膜的磷脂双分子层，从而使相互接触的细胞膜之间发生融合，进而细胞质沟通，形成一个双核或多核融合细胞。 3. 电融合：是指细胞在电场中极化成偶极子，并沿着电力线排列成串，然后用高强度、短时程的电脉冲击穿细胞膜而导致细胞融合。 『实验内容和方法』 1、鸡红细胞悬液的制备:注射器内先吸入2 ml Alsever溶液，从鸡翼下静脉取2ml鸡血，注入离心管，再加入6 ml Alsever溶液，使之成为1：4的悬液。 (Alsever溶液：葡萄糖2.05g，柠檬酸钠0.80g，NaCl 0.42g，溶于100ml双蒸水中。Alsever液能起到抗凝作用又能起到保护作用,可用来暂时保存细胞。) 2、取鸡红细胞悬液1ml，加5ml生理盐水，1200r/min离心5min，去上清（注意：用吸管吸出，如直接倒会损失红细胞），再以上述条件离心洗涤两次。 3、将沉淀加入5ml GKN液，混匀。 （GKN溶液：NaCl 8g，KCl 0.4g，Na2HPO4·2H2O 1.77g，NaH2PO4·H2O 0.69g，葡萄糖2g，酚红0.01g，溶于1000ml水中。维持pH与渗透压，保证细胞的正常形态和活性，使成为细胞悬液，便于融合。） 4、计数，稀释至每毫升1.5×106个。(可选步骤) 5、悬液1ml放入37℃预热。同时将50%PEG液预热（注意：否则PEG冷却会有结晶析出，影响浓度）。 （50％PEG溶液：称取一定量的PEG（WM＝4000）放入烧杯中，沸水浴加热，使之熔化，待冷却至50℃时，加入等体积预热至50℃的GKN溶液，混匀，置37 ℃备用。） 6、待温度恒定后（约15-20min），在1ml细胞悬液中慢慢逐滴加入0.5ml 50%PEG液，边加边摇匀（注意：以免PEG浓度不均匀）放入水浴锅中。 7、细胞融合20-30min后，加入GKN液至5ml，静止于水浴锅中10min左右。 8、取出离心管，1200r/min离心3min，使细胞完全沉降。去上清，加GKN液，,吹匀，再离心一次。 9、去上清，加少量GKN液，混匀，取少量悬液于载玻片上，加入Janus green染液，3min后盖上盖玻片，观察细胞融合情况。 10、实验绘图： 『思考题』 一、在进行细胞融合时要注意那些问题？ 二、计算细胞融合率计算。 融合率 随机计数200个细胞(包括融合的与未融合的细胞)，以融合细胞(含两个或两个以上的细胞核的细胞)的细胞核数除以总细胞核数(包括融合与未融合的细胞核)即得出融合率