提高中期染色体分散方法研究.docVIP

提高中期染色体分散方法研究 　　【摘 要】如何获得分散良好的染色体至今仍是一个让遗传学工作者头疼的问题，然而分散良好的染色体是进行细胞遗传学研究和临床诊断的前提。为了获得分散良好的染色体，遗传工作者进行了各种探索。本文主要从低渗时间、预固定液剂量和环境的相对湿度、温度方面探讨获得分散良好的中期染色体的方法，以期能够对实验室和临床实验中染色体核型分析起到一定的借鉴作用。　　【关键词】染色体；分散方法；影响因素　　【中图分类号】R715.5 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2012）12-0078-02　　染色体检查作为干预出生缺陷、提高人口素质的一个重要内容和措施，对优生优育工作有着重大意义。人类细胞遗传学研究的主要对象是染色体，优良的染色体制片技术无疑就成为细胞遗传学研究的先决条件。染色体制备过程复杂，操作步骤繁多，影响染色体分散的因素也较多。各个实验室虽然在实际工作中已经摸索出了一个自己适用的制备方法，但并不是每一次都能够得到分散良好的中期染色体。如何稳定的获得分散良好的中期染色体，在细胞遗传学研究中仍然是一个难题。本综述主要分析影响染色体制备的几个重要因素。　　1 低渗时间：　　适当的低渗时间是很重要的。低渗时间过短，细胞膨胀程度欠佳，染色体的铺展程度不够，最终得到的核型扭曲而且交叠，不便于染色体核型分析。低渗时间过长，细胞膨胀过度，可能会造成细胞破裂，　　染色体提前释放，出现不完整的核型。提前释放的染色体在滴片过程中随机分布在载玻片上，影响其他细胞的染色体计数和核型分析，这不仅会造成中期分裂相的减少，还会给临床上核型分析带来不必要的麻烦，降低核型分析的效率。同时低渗时间过长，染色体会过度膨胀，显带结果模糊不清，同样不利于染色体的核型分析。根据本实验室的临床实验经验，我们采用0.075mol/L KCl为低渗液，在处理外周血淋巴细胞标本时，低渗时间一般掌握在30～40min，37℃，能够得到足够数量的中期染色体，同时还能有较好的分散效果。　　2固定液的比例：　　实验室常用的固定液是卡诺固定液（冰醋酸：甲醇=1：3 v/v）。冰醋酸能够阻止染色体收缩，保护染色体的结构，抵消乙醇的硬化作用，但是单独用冰醋酸会导致染色体片段的过度膨胀，因此在研究染色体的详细结构时，冰醋酸必须和乙醇或乙醇类似物一起使用。甲醇可以使蛋白质沉淀，具有脱水性，可使蛋白质出现不可逆的变性，使组织硬化。甲醇能够快速的进入组织。一般情况下我们使用的固定液的比例为冰醋酸：甲醇1：3，随着冰醋酸的比例增高，固定液膨胀的效能加大，有利于染色体的铺展。因此在有必要的时候，可以适当提高冰醋酸的比例来提升染色体的铺展。但是如果膨胀过度，则会导致细胞破碎，染色体过度膨胀，从而使染色体丢失，染色体结构模糊，带显分辨率不高，不利于染色体的分析。因此实际工作中，固定液冰醋酸和甲醇的比例一般控制在1：2～1：4之间。　　3预固定液的剂量：　　在细胞预固定环节，不同实验室推荐使用的卡诺固定液的剂量各不相同，在方法学上的重复性欠佳。在常规实验中，实验室工作者注意到预固定时的卡诺固定液用量对中期染色体的最终铺展有着明显的影响。为了探究预固定环节卡诺固定液剂量对染色体分散的影响，桂俊豪[1]等设计了一个定量实验。在预固定时，将卡诺固定液的量分别控制在1.25%、2.50%、3.75%、6.25%和12.25%（终体积浓度）。常规制备中期染色体标本，G显带染色后观察不同预固定剂量下淋巴细胞中期染色体的分散质量，计算中期染色体的铺展面积和染色体的分散质量。该研究发现，当预固定剂量占总体积的1.25%、2.50%或3.75%时，染色体的分散质量较好，可用核型多。当预固定剂量比例≥6.25%后，细胞间相互黏连的程度和细胞间相互积聚的倾向愈发明显。对染色体铺展面积的定量结果显示，预固定液剂量比例为1.25%、2.50%和3.75%时，分裂相核型的平均分布面积分别为1246±236??、1143±178??和1017±163??，均显著高于预固定液剂量为6.25%和12.25%时中期分裂相核型的平均分布面积：876±81??和518±65??，双侧t检验显示组间比较差异显著（P 　　由上可知，中期染色体的扩散主要是在固定液干燥的过程中完成的。因此，若想提高染色体的分散度，从理论上来讲，我们可以通过减慢固定液的挥发速度，延长固定液挥发的时间，得到分散良好的中期分裂相。固定液挥发过快时，染色体分散不开，交叠在一起，对核型分析不利。固定液挥发速度合适时，能够得到分散良好的中期染色体，染色体重叠数少，断裂数少，缺失数少。固定液挥发过慢时，染色体容易断裂，卷曲，缺失，虽然分散面积较大，但是同样不利于染色体核型分析。环境中的相对湿度[5]，影响着固定液的挥发速度。当温度不变时，相对湿度越高